臨床兒童感染肺炎支原體的臨床分型以及CARDSTX基因的驗證

麥榮嘉 黃研 馬丹娟 鄧文喻

廣東省婦幼保健院，廣州 510010

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是一種無細胞壁、形態呈高度多樣性、能通過除菌濾器、能在無生命培養基中生長繁殖的最小原核細胞型微生物。MP是呼吸道感染常見的病原體，全年均可致病，以秋冬季節發病為主，有一定流行趨勢，不同地域、季節發病率不一，好發于兒童、青少年［1］。MP感染具有較高的發病率和臨床意義，但仍是一種被低估的疾?。?］。為了更好地了解MP的流行狀況，分子生物學分型是監測和調查的有效方法。目前，快速循環聚合酶鏈反應（rapid-cycle polymerase chain reaction polymerase chain reaction，Rapid-Cycle PCR）能快速、高效地對MP進行臨床分型［3］。近年來，獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDSTX）的發現，為MP感染引發免疫損傷提供有力證據［4-5］。目前國內對MPCARDSTX罕有報道［6］，而CARDSTX基因序列的研究未見報道。因此，本研究擬檢測本院2019年兒童急性呼吸道感染患者MP的感染率，并用Rapid-Cycle PCR對MP臨床菌株進行P1基因分型，了解本地區MP的流行情況；同時運用PCR擴增CARDSTX基因，比對分析標準株M129型與臨床株的CARDS基因序列，了解臨床MP的CARDSTX基因序列保守性。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗保存的標準菌株M129型（ATCC29342）。支原體液體培養基CM403購自美國Invitrogen公司。

1.2 MP臨床菌株的分離培養和DNA提取

1.2.1 臨床MP的鑒定 本實驗通過收集2019年本院臨床診斷為急性呼吸道感染的住院患兒咽拭子標本165例，使用Real-time PCR鑒定MP臨床菌株。使用達安基因公司的肺炎支原體核酸檢測試劑盒DNA，嚴格按試劑說明書進行操作。

1.2.2 MP臨床標本的處理以及培養［7］對于鑒定為MP陽性標本的前提下，收集相關患兒的痰液標本或者支氣管灌洗液標本進行MP菌株培養分離。首先，在痰液標本加入終濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶，置37℃水浴作用30 min，中間不時搖動3～4次，見痰液標本明顯液化即可，再加等量CM403肉湯培養液稀釋培養。而對于支氣管灌洗液標本，12 000轉/min（離心半徑為9.8 cm），離心10 min，倒去上清，取沉淀于3 ml CM403培養液中。再者，將上述樣品置于37℃溫箱培養6 h后，再用0.22μm濾膜針頭式濾菌器濾除雜菌，然后將濾液用CM403肉湯培養液再補足至5 ml，于37℃、5%CO2溫箱繼續培養5～7 d，同時設置陰性對照，每日觀察液體培養基顏色變化。若≥4 d時培養液顏色由紅變黃且清亮不混濁，表明MP生長，陰性對照無顏色變化；另外取100μl菌液加入1 ml CM403肉湯培養液中繼續培養得到MP純種。使用天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒提取菌液的基因組DNA，嚴格按試劑說明書進行操作。

1.3 MP的臨床分型 根據MPP1基因多態性和參考文獻［8-9］合成Rapid-Cycle PCR法的擴增引物：P1-40、MPAW2；PnG1S、MPI-A2；PnG2S、PnG2A。引物序列和擴增片段大小見表1，合成Rapid-Cycle PCR法的擴增引物，行兩輪PCR擴增。先用P1-40/MPAW2為外側引物進行第一輪擴增。然后以擴增產物為模板，用內側引物PnG1S/MPI-A2擴增P1-1型（607 bp）；PnG2S/PnG2A擴增P1-2型（265 bp）。PCR條件均參照文獻［9］。

表1 Rapid-Cycle PCR法的引物序列

1.4 CARDSTX基因的驗證、測序以及比對 根據MP全基因序列（MPN372）設計包含CARDSTX基因序列擴增片段，用軟件Premier 5.0自行設計引物：CARDS-F和CARDS-R，序列長度2380bp（包含CARDS基因序列1760bp）。反應條件：94℃預變性10 min，98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸20 s，共34個循環；最后72℃10 min延伸，終止反應。隨機選取5株MP臨床株的CARDSTX基因擴增產物送至廣州艾基生物公司進行測序，并將標準株M129型的CARDSTX基因序列（基因編碼：DQ447750）與臨床株測序結果分別進行比對。

2 結 果

2.1 鑒定臨床MP標本 165例臨床住院兒童急性呼吸道感染咽拭子標本中，其中31例（18.79%）熒光PCR信號陽性（＞5×102copies/ml），見圖1。

圖1 MP臨床株的Rapid-Cycle PCR鑒定

2.2 MP菌株的分離培養 將處理后的MP臨床標本接種于CM403液體培養基，培養結果見圖2。MP生長過程中，利用葡萄糖并分解產生酸性代謝物質，使培養基pH發生改變，使酚紅指示劑由紅色變成橘黃色。最終分離培養獲得臨床MP分離株為25株，其中有6株沒能分離成功。

圖2 MP臨床株在CM403液體培養基中的培養結果

2.3 MP菌株的Rapid-CyclePCR分型 以P1-40/MPAW2引物擴增的第1輪產物為模板，用PnG1S/MPI-A2擴增出607 bp的DNA片段為MPP1-1型。結果顯示，25株MP臨床株均擴增出607 bp條帶，說明25株均為P1-1型菌株（圖3）。25株臨床株均未擴增出P1-2型265 bp條帶。

圖3 5株MP臨床株Rapid-Cycle PCR分型的鑒定

2.4 MP菌株的CARDSTX基因擴增以及測序 用引物CARDS TX-F/R對25株臨床株進行PCR，均擴增出2 380 bp目的片段（圖4）。隨機選取5株臨床株的CARDS TX基因測序，并與genbank數據庫的M129序列同源性達99.88%。

圖4 5株MP臨床株CARDSTX基因的鑒定

3 討 論

MP作為嬰幼兒、青少年呼吸道感染的主要病原體之一，感染后臨床表現常無特異性，易于與其他病毒、細菌所致的呼吸道感染相混淆，且對抗生素敏感性具有特殊性，所以臨床對于檢測MP具有十分重要的意義［1-2，10］。目前，最常用MP分型主要根據P1基因重復序列的核酸差異為主要依據，分為P1-1型和P1-2型［11-12］。由于P1基因含有RepMP 4和RepMP 2/3兩個重復序列易發生基因突變或重組，可導致表面膜蛋白P1氨基酸序列的改變而形成新亞型。根據報道，每隔3～7年MP可發生1次地域流行或爆發，這與MP的分型轉換流行相關［8］。本試驗從本院收集的165例急性呼吸道患者的咽拭子標本中共檢出31例MP臨床菌株，陽性率為18.79%。

目前，P1限制性片段長度多態性分析（RFLP）、多位點變量數串聯重復分析（MLVA）、多位點序列分型方法、單核苷酸多態性、Rapid-Cycle PCR、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜和全基因組測序分析都被用于MP的分型［13-14］。Rapid-Cycle PCR是MP分型最為實用的方法之一，并且操作簡單，得到廣泛應用。本試驗通過Rapid-Cycle PCR獲得25株P1-1型菌株，未檢出P1-2型菌株。分離臨床株在MP感染的致病性中，除了通過表面膜蛋白P1的變異、莢膜樣物質的抗吞噬作用等逃避宿主免疫系統的防御外，CARDSTX的發現對于了解MP的致病有重要意義。目前發現CARDSTX是MP感染宿主細胞的主要毒性蛋白，在促發氣道炎癥及維持氣道高壓狀態中扮演重要角色［4-5，12］。Kannan等［4］、Becker等［5］通過研究CARDSTX的編碼基因及其功能，證實其毒素功能區和結構區與百日咳毒素蛋白S1相似；其毒素的二磷酸腺苷-轉移酶N端殘基就像百日咳毒素蛋白一樣，保留煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結合催化基團和催化谷氨酸殘基。有研究發現，P1-2型菌株可以高表達CARDSTX，相比P1-1型菌株更具有侵襲性。然而本研究通過檢測25株MP的臨床分離P1-1型菌株，均攜帶CARDSTX基因序列；并根據測序結果，與數據庫的M129同源性達99.88%，說明CARDSTX基因高度保守。而對于P1-1型菌株與P1-2型菌株CARDSTX表達差異，還需要進一步的研究。

綜上所述，本研究收集地區臨床MP感染菌株，通過Rapid-Cycle PCR分型，了解本地區MP流行主要以P1-1型為主。并且通過驗證MP臨床株的CARDSTX基因，發現其具有高度保守性，或許能成為MP感染的新靶標。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。