MTT 法和瓊脂擴散法在殼聚糖創傷敷料細胞毒性試驗中的應用

刁立琴，高保栓，韓婷，王亞茹

河北省藥品醫療器械檢驗研究院 （河北石家莊 050227）

殼聚糖是一種天然的堿性多糖，具有抗菌、止血、促進傷口愈合等生物活性[1]。羧甲基殼聚糖則是一種水溶性的殼聚糖衍生物，由其冷凍干燥而成的殼聚糖創傷敷料是一種新型的創傷敷料，目前被廣泛應用于外科創面的治療中。近年來，隨著對殼聚糖研究熱度的增加，市場上出現了一些殼聚糖類產品，但由于產品制備方法和生產工藝的不同，導致其具備不同的特性。因此，如何對各類產品進行科學的生物學評價是目前面臨的一個重要問題。

細胞毒性試驗是一種體外試驗，具有周期短、敏感度高、可以快速批量篩選樣品的特點，常作為生物學評價的首選項目。本研究采用MTT 法和瓊脂擴散法進行殼聚糖創傷敷料的體外細胞毒性試驗，探討該類產品細胞毒性試驗方法的適用性，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗樣品為殼聚糖創傷敷料（由羧甲基殼聚糖冷凍干燥而成，來自生產企業送樣）；細胞為小鼠成纖維細胞L-929（中國科學院上海生命科學院細胞資源中心）；主要試劑包括 MEM培養基（賽默飛世爾科技有限公司），胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd），DMSO（賽默飛世爾科技有限公司），異丙醇（天津市百世化工有限公司），ZDBC的聚氨酯膜（Hatano Research Institute，FDSC），高密度聚乙烯膜（Hatano Research Institute，FDSC），0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司），MTT（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法

試驗液的制備如下。（1）樣品浸提液：根據GB/T 16886.12-2017《醫療器械生物學評價 第12部分：樣品制備與參照材料 》中的要求，浸提比例選擇6 cm2/ml，加入含10%胎牛血清的MEM 培養液，37 ℃浸提24 h，作為樣品原液，并用空白對照液倍比稀釋制備樣品1/2、1/4、1/8組。（2）空白對照液：同批含10%胎牛血清的MEM 培養液。（3）陰性對照液：高密度聚乙烯膜按3 cm2/ml 的比例加入含10%胎牛血清的MEM 培養液，37 ℃浸提24 h。（4）陽性對照液：10%的DMSO。

試驗方法依據GB/T 16886.5-2017《醫療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗》[2]進行：將1×105/ml 細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μl，37 ℃孵育24 h 后，去掉原培養液；分別加入樣品或空白、陰性、陽性對照液，每孔100 μl，37 ℃孵育24 h；去掉原培養液，每孔加入50 μl 濃度為1 mg/ml 的MTT 溶液，繼續培養2 h 后吸出孔內溶液，加入100 μl 異丙醇，振蕩10 min，在酶標儀570、650 nm 雙波長下測定光密度（optical density，OD）值。

細胞存活率（relative growth rate，RGR）的計算及評價：RGR（%）=（100×OD570e）/OD570b，其中OD570e為樣品組或陰性、陽性對照組的光密度平均值，OD570b為空白對照組光密度平均值；RGR＜空白對照組的70%，表明具有潛在細胞毒性。

1.2.2 瓊脂擴散法

試驗液的制備如下。（1）樣品浸提液：同MTT 法，取浸提原液和1/8組進行試驗。（2）陰性對照液：0.9%氯化鈉注射液。（3）陽性對照液：10%的DMSO。

試驗方法依據YY/T 0127.9-2009《口腔醫療器械生物學評價 第2單元： 試驗方法 細胞毒性試驗：瓊脂擴散法及濾膜擴散法》[3]進行：均勻接種2.5×105/ml 細胞懸液于直徑為90 mm 的培養皿中，每皿10 ml，37 ℃孵育24 h；將已滅菌的3%瓊脂培養基加熱至48 ℃孵育，與預熱至48 ℃的2倍MEM 培養基1∶1混合；吸出每個平皿中的培養液，分別加入10 ml 新鮮的瓊脂培養基，室溫下放置凝固后，每皿加入10 ml 中性紅染色液，在暗處放置20 min 后，去掉多余的染液；吸取0.01 ml 浸提液加至直徑為5 mm 的圓形濾紙片上，將濾紙片貼在瓊脂表面上，同時做陰性、陽性對照；將培養皿于37 ℃孵育24 h 后，在倒置顯微鏡下觀察，記錄每一樣品周圍及下方的細胞反應區域是否有褪色和溶解現象，并評價細胞毒性反應級別，評價方法見表1。

表1 細胞毒性反應分級（瓊脂擴散法）

2 結果

2.1 MTT 法結果

MTT 法結果顯示，樣品原液組和1/2、1/4、1/8組的RGR 分別為59%、71%、87%、90%，見表2。

表2 MTT 法結果

2.2 瓊脂擴散法結果

孵育24 h 后，在倒置顯微鏡下觀察，陰性對照周圍及下方未觀察到反應區域，毒性分級為0級；陽性對照周圍及下方反應區域超出樣品＞1.0 cm，細胞溶解率＞80%，毒性分級為4級；樣品原液組反應區域距樣品邊緣＞0.5 cm 但＜1.0 cm，細胞溶解率＞50%但＜80%，毒性分級為3級；樣品1/8組反應區域僅局限在樣品下方，細胞溶解度＜10%，毒性分級為2級。試驗結果見表3。

表3 瓊脂擴散法結果

3 討論

GB/T 16886.5-2017中規定，評價醫療器械細胞毒性時按體外細胞毒性試驗進行，試驗方法包括浸提液試驗、直接接觸試驗和間接接觸試驗三類，其中浸提液試驗中的MTT 法最為常用。MTT 法可通過代謝活性定量測定RGR，也更適合醫療器械產品中固體類產品的檢驗。殼聚糖創傷敷料可以很好地溶解于浸提介質中，現行標準并未對于此類可溶性產品規定具體的檢測方法，需要試驗者進行選擇。

瓊脂擴散法是一種定性評價細胞毒性的方法，也是一種長期被廣泛應用的標準試驗方法，該方法不適用于不能通過瓊脂擴散或可能與瓊脂相互作用的物質。本研究結果顯示，殼聚糖創傷敷料可以采用該方法進行毒性分級評價，且殼聚糖創傷敷料的臨床應用為直接外敷，采用瓊脂擴散法更貼近實際應用情況；但瓊脂擴散法的結果受試驗者主觀影響較大，可同時采用MTT 法進行定量檢驗，以避免單一方法的弊端。

不同的細胞毒性試驗方法具有不同的評判標準，所反映的細胞毒性大小和靈敏度也會有所差別[4]。劉永帥[5]在測試葡聚糖磁性納米材料的細胞毒性時指出，采用MTT 法進行試驗出現了假陰性結果，過高地評價了細胞毒性。刁立琴等[6]的研究結果表明，MTT 法試驗中，浸提液制備方法不同，得到的細胞毒性評價結果存在顯著差異。本研究采用MTT 法聯合瓊脂擴散法對殼聚糖創傷敷料進行細胞毒性試驗，發現樣品原液組、1/8組兩種浸提濃度的細胞毒性結果一致，更全面地評價了該敷料的細胞毒性結果。

綜上所述，采用MTT 法和瓊脂擴散法進行殼聚糖創傷敷料的細胞毒性試驗，樣品原液組和1/8組的細胞毒性結果一致，兩種方法聯合應用可避免單一方法得出過高或過低的評價結果。