核磁共振定量技術(shù)測(cè)定原薯蕷皂苷對(duì)照品的含量

韓 君，林 帥

（1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司 中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，北京 101301；2.康龍化成（北京）新藥技術(shù)股份有限公司，北京 100176）

原薯蕷皂苷（protodioscin），分子式為C51H84O22，屬于甾體皂苷，又名呋喃固醇皂苷，有多種藥理作用，如增強(qiáng)性功能、降血脂作用、對(duì)癌細(xì)胞的毒殺作用和抗白血病作用[1]。原薯蕷皂苷為穿山龍主要生物活性成分，由于其在中藥提取過(guò)程中易發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)[2]且分離純化中易存有雜質(zhì)[1]，且原薯蕷皂苷極具吸濕性，在應(yīng)用常規(guī)的含量測(cè)定方法，如高效液相色譜法[3]、液質(zhì)聯(lián)用法[4]等進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)紫外吸收較弱，易受雜質(zhì)干擾等造成含量測(cè)定不準(zhǔn)確[5]，且耗費(fèi)大量人力物力。因此，有必要探索新的技術(shù)與方法對(duì)原薯蕷皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定。

核磁共振定量技術(shù)（qNMR）不受殘留溶劑、水分、無(wú)機(jī)雜質(zhì)（灰分）及活性成分雜質(zhì)的影響，測(cè)定對(duì)照品的絕對(duì)含量，其測(cè)定時(shí)間短、樣品量少等優(yōu)點(diǎn)[6]，近年來(lái)廣泛應(yīng)用在對(duì)照品和藥品的質(zhì)量控制研究領(lǐng)域[7-12]，應(yīng)用qNMR對(duì)原薯蕷皂苷對(duì)照品含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。本文應(yīng)用qNMR測(cè)定原薯蕷皂苷含量，為在無(wú)對(duì)照品情況下進(jìn)行含量測(cè)定和相應(yīng)質(zhì)量控制建立方法。

圖1 原薯蕷皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical construction of protodioscin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCEII 500MHz超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；1～200μL移液槍（Thermo公司）。

氘代吡啶（氘代度＞99.9%美國(guó)CIL公司）；TMS（北京化工廠）；原薯蕷皂苷（102498江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司）；RFS-Y13011812016（成都瑞芬思生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備

內(nèi)標(biāo)溶液配制 1μL內(nèi)標(biāo)加3mL吡啶配成濃度為0.22mg·mL-1溶液。

樣品溶液配制 稱量原薯蕷皂苷對(duì)照品2.7mg，溶解在0.4mL含有內(nèi)標(biāo)溶液的吡啶溶劑中。

線性溶液配制 將20mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解在1mL的吡啶溶劑中配成濃度為20mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次往核磁管加入上述100,150,200,250,300μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次加入300,250,200,150,100μL的吡啶溶劑。

1.2.2 核磁實(shí)驗(yàn)條件

1H NMR的工作頻率為500.13MHz，譜寬為50000.50Hz，測(cè)試溫度為25℃，環(huán)境濕度為45%，采集時(shí)間3s，掃描次數(shù)16次，激發(fā)脈沖為12.11us。在對(duì)譜圖進(jìn)行處理之前，先進(jìn)行相位校正和基線調(diào)平。所有譜圖均采用Topspin 4.0.8軟件處理。

1.2.3 qNMR計(jì)算公式

采用（1）式計(jì)算原薯蕷皂苷對(duì)照品含量：

式中 As、Ar：供試品特征峰和內(nèi)標(biāo)峰的峰面積；Ms、Mr：供試品和內(nèi)標(biāo)物的分子量；ns、nr：供試品特征峰和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)子數(shù)；ms、mr：供試品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；Wr：內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 原薯蕷皂苷氫譜解析

按照NMR實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定結(jié)果采集圖譜，樣品及內(nèi)標(biāo)的氫譜見(jiàn)圖2，樣品的氫譜解析見(jiàn)表1。

表1 原薯蕷皂苷核磁共振氫譜特征信號(hào)的歸屬Tab.1 1H NMR data for protodioscin in pyridine-d5

因原薯蕷皂苷和TMS在氘代吡啶中溶解度良好，且氘代吡啶的溶劑峰處于較低場(chǎng)，與內(nèi)標(biāo)物和樣品特征峰無(wú)干擾，因此，選擇氘代吡啶為溶劑。采用NMR對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量時(shí)，供試品與內(nèi)標(biāo)物通常會(huì)有很多峰。按qNMR定量要求，用于定量的供試品特征峰和內(nèi)標(biāo)峰應(yīng)選擇與其它峰完全分離，沒(méi)有雜質(zhì)峰干擾。按照上述要求，選擇TMS作為內(nèi)標(biāo)峰，以原薯蕷皂苷的峰δ5.84為供試品的定量峰。

2.2 線性關(guān)系

取1.2.1項(xiàng)下5個(gè)供試品的溶液，測(cè)定氫譜，分別對(duì)原薯蕷皂苷特征峰和TMS內(nèi)標(biāo)信號(hào)的峰面積進(jìn)行積分，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 原薯蕷皂苷和TMS的質(zhì)量及峰面積積分值Tab.2 Mass and peak area integral value of protodioscin and TMS

以原薯蕷皂苷特征峰和TMS的積分面積比值y對(duì)原薯蕷皂苷和TMS質(zhì)量比值x做線性方程，得到回歸方程為y=0.2035x-0.572，其相關(guān)系數(shù)r=0.994。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn)

取“線性”項(xiàng)下4號(hào)樣品，按照1.2.2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件連測(cè)6次，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計(jì)算分別為1.03、1.02、1.03、1.02、1.02、1.03，RSD為0.53%，表明精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按照1.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備，平行制備供試品溶液6份，按照1.2.2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計(jì)算分別為0.68、0.68、0.68、0.68、0.67、0.68，RSD為0.60%，表明重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“線性”項(xiàng)下4號(hào)樣品，按照1.2.2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件，分別于0、4、6、8、10h測(cè)定，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計(jì)算分別為1.02、1.01、1.02、1.02、1.03，RSD為0.69%，表明穩(wěn)定性良好。

2.6 耐用性試驗(yàn)

取“線性”項(xiàng)下4號(hào)樣品，分別在溫度為25和30℃下測(cè)定，以原薯蕷皂苷特征峰和TMS積分面積比值計(jì)算分別為1.03、1.04，RSD為0.68%，表明耐用性良好。

2.7 樣品測(cè)定

按照1.2.1項(xiàng)下供試品溶液制備，測(cè)定原薯蕷皂苷對(duì)照品的特征峰及其內(nèi)標(biāo)TMS的積分面積，根據(jù)計(jì)算公式（1）求得原薯蕷皂苷的絕對(duì)含量，同時(shí)采用HPLC峰面積歸一化法測(cè)定原薯蕷皂苷對(duì)照品的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 原薯蕷皂苷含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of the content of protodioscin

3 結(jié)論

本文采用qNMR測(cè)定原薯蕷皂苷對(duì)照品含量，結(jié)果其線性、精密度、耐用性、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好。qNMR法相對(duì)于常規(guī)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)，核磁信號(hào)能給出樣品結(jié)構(gòu)信息，無(wú)需特定對(duì)照品，內(nèi)標(biāo)物廉價(jià)易得，方法簡(jiǎn)便快捷。因此，qNMR測(cè)定原薯蕷皂苷對(duì)照品含量的方法可行，具有進(jìn)一步研究的潛力與價(jià)值。