脫色希瓦氏菌S12對十溴聯苯醚的利用及其降解特性研究*

江利梅，聶麗君，牛顯春，劉正輝c，毛玉鳳，向音波

（1.廣東石油化工學院a環境科學與工程學院；b生物與食品工程學院；c廣東省石油化工污染過程與控制重點實驗室，廣東 茂名 525000；2.茂名市有機污染控制工程技術研究中心，廣東 茂名 525000）

多溴聯苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）作為溴代阻燃劑被廣泛應用于電子電器、石油化工和建筑材料等產品中，其共有209種同系物，目前，商品化的PBDEs種類主要包括五溴聯苯醚（Penta-BDEs）、八溴聯苯醚（Octa-BDEs）和十溴聯苯醚（Deca-BDEs，又稱BDE-209），且十溴聯苯醚的使用量最大[1]。PBDEs是一類新型持久性有機污染物，具有致突變性和致癌性，其親脂性和生物易累積等特點使其極易在生物體內蓄積，并通過食物鏈逐級放大[2]，尤其是Penta-BDEs和Octa-BDEs具有較高的生態毒性在全球范圍內正在逐步禁用[3]。而BDE-209的環境和生態毒性尚未定論，因此，在全球仍被廣泛使用[4]。我國BDE-209的產量和用量均位居世界首位，導致我國大氣、水體和土壤中甚至人體血清中均檢出非常高濃度的BDE-209[5-7]。PBDEs對環境和生物體的影響已成為研究者們關注的熱點問題。

目前，降解PBDEs的方法主要有物理法，化學法和生物法[8]。物化降解法容易產生毒性更大的低溴代或者羥基化產物，而生物降解法由于成本低廉且可實現環境中PBDEs的原位生物修復而被普遍看好[9]。已報道發現，多種微生物能厭氧降解PBDEs，但其降解能力、降解程度和降解產物受微生物種類和降解底物結構的影響。例如，He等研究發現，BDE-209能被硫螺旋菌厭氧脫溴生成七溴和八溴代產物[10]。Lip等利用GY2菌群降解四溴聯苯醚（BDE-49、BDE-99和BDE-100）混合物，研究發現GY2菌群對其降解速率分別為36.9、19.8和21.9nmol·d-1，產物降解為無溴代的聯苯醚,降解率達到88%～100%,其中，脫鹵菌屬的生長與PBDEs的脫溴降解緊密相關[11]。此外，Huang等也研究發現，土壤中BDE-209的殘余量與土壤微生物的生物量呈顯著負相關關系，表明厭氧微生物能夠代謝降解BDE-209并為自身生長提供碳源和能量[12]。本研究利用脫色希瓦氏菌S12作為降解菌，以BDE-209為目標底物，分析BDE-209對脫色希瓦氏菌S12生長的影響及其降解特性，為PBDEs污染原位生物修復提供參考數據。

1 實驗部分

1.1 菌株來源

脫色希瓦氏菌S12（Shewanella decolorationis S12）由Xu等從廣東某印染廢水處理廠的活性污泥中分離純化獲得[13]。

1.2 試劑和儀器

BDE-209（AR純度＞98%TCI公司）；PBDEs同系物（標準品AccuStandards公司）；二氯甲烷、二甲基亞砜和正己烷（色譜純 德國CNW公司）。

QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀(島津公司);DU640紫外分光光度計（Beckman公司）;Bugbox厭氧工作站（Ruskinn公司）。

1.3 BDE-209及其代謝產物分析方法

將培養75d后的培養液,按水相∶有機相=2∶1（v/v）的比例，添加正己烷超聲萃取，超聲萃取3次，每次5min，收集萃取液到棕色容量瓶中，最后用正己烷定容，測定前取1mL萃取液用0.22μm有機相濾膜過濾至1.5mL棕色樣品瓶中，利用氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）分析DBE-209及其代謝產物。代謝產物由中國科學院廣州地球化學研究所分析，具體分析方法參照文獻[14]。

1.4 BDE-209對脫色希瓦氏菌S12生長的影響

60mL棕色瓶中分別加入粉末狀BDE-209（即添加以二氯甲烷助溶的BDE-209，將二氯甲烷完全揮發）、二甲基亞砜助溶的BDE-209和二甲基亞砜純溶液（對照），然后按2%（v/v）接種量接種S12菌于培養瓶中，添加60mL無機鹽培養液（即乳酸鈉20mmol·L-1、丁二酸鈉20mmol·L-1和酵母0.1%），30℃靜置避光培養，定期取出1mL培養液用于分析OD600和電鏡觀察菌體細胞。

1.5 脫色希瓦氏菌S12降解BDE-209的特性

20mL棕色瓶中加入1.25mL二甲基亞砜助溶的濃度為800mg·L-1的BDE-209，使培養體系中BDE-209濃度為50mg·L-1，添加20mL無機鹽培養液（即乳酸鈉20mmol·L-1、丁二酸鈉20mmol·L-1和酵母0.1%），然后按1%（v/v）接種量接種S12菌（OD600為0.5）于棕色培養瓶中，30℃靜置避光培養，定期添加固態培養基成分并搖勻溶解。每組實驗設3個平行，并設置一組不接S12的空白對照。

2 結果與討論

2.1 脫色希瓦氏菌S12對BDE-209的利用特性

BDE-209在水中的溶解度極低，通常僅為20～30μg·L-1，但在助溶劑條件下其溶解性可大大提高。為了闡明脫色希瓦氏菌對BDE-209的利用特性，分別采用二氯甲烷和二甲基亞砜作為助溶劑，分析比較脫色希瓦氏菌S12在不同BDE-209濃度條件下的生長情況，結果發現，菌株S12對BDE-209的利用程度與所采用的助溶劑緊密相關，當以二甲基亞砜助溶時菌株S12能以BDE-209為厭氧呼吸的電子受體獲得生長。例如，實驗采用二氯甲烷助溶方式添加BDE-209，待二氯甲烷揮發完全后添加無機鹽培養基，控制BDE-209在培養體系中的濃度分別為0、30、300和900μg·L-1，接種S12菌以后置于厭氧工作站30℃靜置避光培養，間隔時間取出1mL培養液用于分析OD600值，結果見圖1。

圖1 不同濃度BDE-209對脫色希瓦氏菌S12生長的影響Fig.1 Effects of Different Concentrations of BDE-209 on the Growth of Shewanella Decolorized S12

在培養24h時，不同BDE-209濃度實驗組測得的OD600值分別為：0.113（0μg·L-1）、0.120（30μg·L-1）、0.106（300μg·L-1）和0.087（900μg·L-1）。當BDE-209濃度低于理論水溶解度30μg·L-1時，S12菌體生長沒有受到任何影響。相反，當BDE-209濃度大于30μg·L-1，菌體濃度隨著BDE-209濃度的升高而減少，隨著培養時間的延長，這種減弱生長的現象并沒有得到解除。

但當把BDE-209的濃度增加到50mg·L-1并以粉末狀態添加到培養基中時，卻獲得了另外的結果。雖然在24h前高濃度BDE-209同樣抑制了S12菌的生長，但24h以后培養基中的酵母消耗完全以后，S12菌反而可以利用BDE-209獲得生長。沒有添加BDE-209的S12菌在24h前OD600獲得增加，在24h后由于酵母的消耗OD600維持在0.014左右，而添加50mg·L-1粉末BDE-209的S12菌在24h前OD600增加僅為沒有添加BDE-209的S12菌的一半，但是在24h后OD600卻能維持在0.028左右。而當BDE-209以二甲基亞砜（DMSO）助溶方式添加到培養基中時，S12菌在24h前的生長也收到了抑制，OD600增加也僅為沒有添加BDE-209的S12菌的一半。但是24h以后S12菌利用BDE-209生長的狀態尤為明顯，OD600基本維持在0.08以上（見圖2）。

圖2 不同溶解方式的BDE-209對脫色希瓦氏菌S12生長的影響Fig.2 Effects of BDE-209 with different dissolution methods on the growth of Shewanella decolorized S12

由圖2結果可知，當BDE-209濃度低于理論水溶解度的30μg·L-1時，這種持久性有機污染物并沒有對希瓦氏菌S12的生長產生影響，而高于這個濃度的BDE-209在培養前期（約24h）都會抑制S12菌的生長。如果BDE-209濃度達到一定程度如50mg·L-1時，在S12菌生長受抑制的情況下，BDE-209可以作為電子受體被還原從而為S12菌提供能量生長，這種維持生長狀態以二甲基亞砜溶解態的BDE-209比粉末態的BDE-209更為明顯。相反，如果BDE-209濃度沒有達到一定程度時，則不能維持S12生長的需要，僅表現出生長受抑制的現象。

同時，對不同時間段的菌體細胞進行電子顯微鏡觀察也證實了上述實驗結果，22h時3個實驗組的S12菌體細胞結構都完整；46h時沒有添加BDE-209的S12大部分菌體細胞質開始出現凝結，而添加BDE-209實驗組的S12菌細胞結構保持完整，且細胞外膜覆蓋有較松散的物質；70h時，沒有添加BDE-209的S12菌體大部分開始死亡，而添加BDE-209的S12菌體細胞結構仍然保持完整。到了168h沒有添加BDE-209的S12菌體基本死亡，而添加粉末狀的BDE-209的S12菌體細胞液開始出現凝結，但添加DMSO溶解的BDE-209的S12具體細胞仍保持著完整結構（如圖3），這也從另一方面說明BDE-209在營養物質酵母消耗完全以后可以維持S12生長的需要。這與huang等[12]的研究結果相一致。

圖3 菌株S12與BDE-209不同接觸時間的菌體電子顯微鏡圖Fig.3 Electron micrograph of S12 at different contact time with BDE-209

2.2 脫色希瓦氏菌S12對BDE-209的降解特性

通過GC-MS分析研究S12菌對BDE-209的降解率及其代謝產物，發現培養75d后，S12對BDE-209的降解率為81.07%(空白對照為8.02%)，見圖4。

圖4 培養75d后BDE-209的降解率Fig.4 Degradation rate of BDE-209 after 75d incubation

其降解代謝產物主要為八溴代和九溴代產物，其中八溴代產物有BDE-201（2.124μg·L-1）、BDE-2022（2.029μg·L-1）、BDE-203（2.393μg·L-1）、BDE-196（1.725μg·L-1）和BDE-197（2.171μg·L-1）；九溴代產 物 有BDE-208（48.859μg·L-1）、BDE-207（76.718μg·L-1）和BDE-206（47.918μg·L-1），見圖5。該培養體系中未測出七溴代及以下的代謝產物。這與Gerecke等報道的利用厭氧污泥為載體，BDE-209可被微生物還原脫溴生成九溴聯苯醚和八溴聯苯醚的結果一致[15]。雖然S12菌對BDE-209的降解率達81.07%，但檢測到的代謝產物遠低于降解值，原因可能是S12菌除了能還原脫溴降解外，還具有其他降解途徑，如羥基化、甲基化或醚鍵斷裂等[2]，而本樣品前處理和分析檢測方法未能檢測到。

圖5 降解產物的組成及含量Fig.5 Composition and content of degradation products

3 結論

（1）在二甲基亞砜助溶條件下，脫色希瓦氏菌S12能以BDE-209為厭氧呼吸的電子受體獲得生長，實現BDE209的降解轉化。該研究為進一步了解和掌握希瓦氏菌的生理生化特點，更好地利用微生物進行環境污染治理提供重要指導作用，但后續還需借助生物化學和分子生物學等技術手段深入分析微生物，利用BDE-209的相關代謝網絡機理。

（2）脫色希瓦氏菌S12具有高效厭氧降解BDE-209能力，降解率為81.07%，這為進一步開展多溴聯苯醚等持久性有機污染物的生物修復提供了寶貴菌種資源和參考數據。但后續仍需不斷優化和改進代謝產物的分析方法，以便更好地追蹤BDE-209的去路和降解途徑。