SLC蛋白對青海湖裸鯉腸道排泄及酸堿平衡的影響

李 航，王 萍，來琦芳，史建全，周 凱，高鵬程，祁洪芳，么宗利

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部東海漁業資源開發利用重點實驗室，鹽堿水域漁業工程技術研究中心（上海），上海 200090；2.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；3.青海湖裸鯉救護中心，西寧 810016）

青海湖裸鯉（Gymnocyprisprzewalskii）俗稱湟魚，屬鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），裂腹魚亞科（Schizothoracinae），裸鯉屬，僅分布在青海湖及其周圍水域中，是該區域重要的經濟魚類。裸鯉具有生殖洄游的特性，能在淡水、半咸水、堿水中生活［1］，具有較強的鹽度變化適應性。每年4—7月份為其繁殖季節，裸鯉溯河而上，至布哈河、沙流河和黑馬河等淡水河流中產卵，繁殖結束后，隨水流進入青海湖繼續生活［2］。青海湖裸鯉在淡水和高鹽堿湖水之間的洄游過程中，由于需要適應水環境中不同的鹽堿度，機體的免疫、呼吸排泄、能量代謝及氨排泄等生理活動以及離子轉運酶基因的表達量均會發生變化［3－7］。

腸道是魚類進行滲透調節及酸堿平衡的主要組織之一，其滲透調節功能與體內碳酸鹽或非碳酸鹽緩沖體系的緩沖作用關系密切［8］。研究表明，海洋硬骨魚類腸道上皮細胞是分泌碳酸氫鹽的主要場所［9］。腸道中的通過頂膜上的Cl－／交換子分泌［10］，SLC4基因家族（solute carrier family 4）和SLC26基因家族（solute carrier family 26）是生物體內編碼轉運蛋白的典型基因家族，并在海灣豹蟾魚（Opsanus beta）［11］、青海湖裸鯉［12］腸道中都有高表達。

SLC4基因家族由10個基因組成（SLC4A1～SLC4A5；SLC4A7～SLC4A11），除SLC4A11基因外，SLC4基因家族中其余基因編碼的蛋白均具有轉運功能，但它們的轉運方式存在差異［13－14］。由SLC4A1、SLC4A2和SLC4A3基因編碼的同源陰離子轉運蛋白AE1、AE2、AE3能介導Cl－和的交換，其中，AE1是紅細胞的Cl－交換體，也是紅細胞中最豐富的膜蛋白。SLC4A2、SLC4A4分別編碼蛋白AE2、NBCe1，并在上皮細胞的基底外側膜表達，是Na＋／的共轉運蛋白，可促進的細胞凈吸收，并參與血液的輸送。其中，NBCe1（SLC4A4）為產電的Na＋／聯合轉運子［15］。

SLC26基因家族編碼的陰離子交換蛋白可轉運Cl－、、I－、OH－、和草酸根等多種陰 離 子，其 中SLC26A3、SLC26A4、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A9和SLC26A11基因是目前被明確發現參與編碼Cl－和交換的重要蛋白［16］。細胞內累積后由頂膜上SLC26A6基因編碼蛋白通過Cl－／交換排出［17］。SLC26A3基因編碼的交換子對Cl－和的轉運比例為2∶1，而SLC26A6基因編碼的交換蛋白每轉運1個Cl－需要2個的參與［18］。

研究表明，SLC26A2、SLC26A3、SLC26A6、SLC26A8等基因編碼的陰離子交換子的轉運活性均可以被4，4′-二異硫氫基芪-2，2′-二磺酸（4，4′-diisothiocyanatostilbene-2，2′-disulfonic acid disodium salt hydrate，DIDS）抑制［18－20］。多數由SLC4基因家族編碼的蛋白也均能被DIDS抑制［19］。基于裸鯉具備在鹽堿水與淡水環境之間自主調節酸堿平衡的能力，本實驗設置淡水組及青海湖鹽堿水組（以下簡稱湖水組），通過注射DIDS抑制離子交換的主要編碼蛋白表達，檢測鹽堿脅迫下裸鯉血液生理指標的變化以及參與排泄的相關蛋白對應基因SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6在腸道中的相對表達變化，以期為揭示鹽堿環境中裸鯉腸道滲透調節和酸堿調節的作用機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用青海湖裸鯉由青海湖裸鯉救助中心提供，實驗開始前于室內暫養2個月以上，暫養用水為凈水機（型號：開能／AC／KDF150-1）處理后自來水，每天早晚各飽食投喂人工配合商品飼料（粗蛋白32%）1次，選取體長（12.81±0.35）cm、體質量（19.21±2.74）g、大小一致的健康個體開展實驗，實驗前48 h停止喂食。

1.2 實驗設計和樣品采集

根據青海湖裸鯉洄游水域水文特征以及青海湖湖水的離子組成和鹽堿度特征，設置淡水對照組（FW control）、淡水抑制組（FW DIDS，淡水并注射DIDS）、湖水對照組（LW control）和湖水抑制組（LW DIDS，湖水并注射DIDS），實驗用水參數設置見表1。淡水組用水為過濾自來水：鹽度0.04±0.02，堿度（1.73±0.03）mmol·L－1；湖水組用水根據青海湖湖水組成特征［3］等比例配制：鹽度14.83±0.04，堿度（29.54±0.11）mmol·L－1。裸鯉放入淡水和湖水40 h后，分別向淡水抑制組和湖水抑制組的裸鯉腹腔注射0.1 mL 10 mmol·L－1DIDS，同時，給淡水對照組和湖水對照組的裸鯉注射等體積的0.7%生理鹽水。實驗用水體積為50 L。每組設置3個重復，每個重復放置9尾裸鯉。為確保實驗用水的穩定性，配方試劑全部溶解后曝氣24 h使用，實驗過程中每天換水50%。實驗期間全程監測水體的鹽度、碳酸鹽堿度、pH及水溫。鹽度和水溫使用YSI 6600多功能水質分析儀（YSI，美國）檢測，pH值用DELTA 320型精密pH計（METTLER TOLEDO，瑞士）檢測，碳酸鹽堿度采用酸堿滴定法測定［21］。

表1 實驗用水參數設置Tab.1 Parameters of experimental water

注射8 h后開始收集腸道排泄物。腸道排泄物收集參照GENZ等［22］的方法：用0.2 g·L－1MS-222麻醉裸鯉，將綁有乳膠收集袋的10μL吸頭開口端插入裸鯉泄殖腔（適當剪去吸頭的頂端部分，以增大開口端口徑），用手術縫合線將其固定后，轉入實驗用水溶液中，實驗結束后將收集袋中的液體置于4℃下保存。而后用經抗凝血劑（肝素鋰）潤洗的1 mL注射器通過尾靜脈穿刺采血。隨即解剖采完血的裸鯉，取出腸道，分離出具有滲透和酸堿調節功能的中腸，置于液氮中速凍后，于－80℃條件下保存。

1.3 實驗方法

用雷度ABL 80血氣分析儀（Radiometer，丹麥）測定采集到的裸鯉靜脈血血氣生理指標。

1.3.2 中腸SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6基因相對表達

將取出的裸鯉中腸組織快速置于1.5 mL RNasefree管中，加入1 mL Trizol（Invitrogen，美國），依據Trizol說明書提取RNA，并用超微量紫外分光光度計（BioTake）測定RNA濃度及純度，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。使用ReverTra Ace-α（TOYOBO，日本大阪）試劑盒逆轉錄合成cDNA第1鏈，總反應體系50μL，42℃延伸20 min，99℃5 min，4℃5 min后，瞬間離心，反轉錄產物置于－20℃保存。

將裸鯉β-actin基因（內參基因）、SLC4A1基因、SLC4A2基因、SLC4A4基因、SLC26A6基因的已知序列（由轉錄組測序獲得）分別與GenBank中斑馬魚（Daniorerio）的對應基因進行比對：βactin（AY222742.1）、SLC4A1（NM＿198338.1）、SLC4A2（AY876015.1）、SLC4A4（NM＿001034984.1）、SLC26A6（FJ170818.1），選擇高度保守區域用于引物設計。引物設計使用Primer 3.0軟件［26］，引物序列見表2，由上海英駿生物技術公司合成。所有引物經驗證均具有良好特異性，反轉錄cDNA產物使用SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa，日本）試劑盒在Light Cycler 1.2（Roche）上進行real-time PCR反應?？偡磻w系為10μL，擴增程序如下：①預變性：95℃30 s；②擴增反應：95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環；③溶解曲線形成：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，延伸階段收集熒光信號，每個樣本設置3個重復。反應結束后，進行溶解曲線分析。以β-actin作為內參基因，基因的相對表達量使用2-△△Ct法［27］計算。

表2 定量PCR引物序列Tab.2 Primer sequences for real-time PCR assays

1.4 數據分析

文中數據用平均值±標準誤（mean±SE）表示。使用SPSS 16.0軟件進行數據統計，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行顯著性分析，如果方差分析具有顯著性，再用LSD法多重比較，顯著水平P＜0.05，使用Origin 8.6軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 血氣指標

相對于淡水對照組，湖水對照組的裸鯉血液pH及離子（包括Na＋、Ca2＋、Cl－）濃度均顯著升高（P＜0.05）（圖1-A，C，D）；二氧化碳分壓（PCO2）顯著降低（P＜0.05），氧分壓（PO2）無顯著變化（P＞0.05）（圖1-B）。在注射DIDS后，淡水抑制組裸鯉血液pH及濃度較淡水對照組顯著升高（P＜0.05），PCO2顯著降低（P＜0.05），PO2、K＋及Ca2＋濃度無顯著變化（P＞0.05）（圖1）。湖水抑制組與湖水對照組裸鯉相比，血液pH及濃度顯著升高（P＜0.05），而PCO2、PO2、K＋及Ca2＋濃度無顯著變化（P＞0.05）（圖1）。相對于淡水抑制組，湖水抑制組中裸鯉pH顯著提高（P＜0.05），PCO2和PO2無顯著變化（P＞0.05）（圖1），累積有增加趨勢，但兩者無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 SLC蛋白抑制劑對淡水及湖水環境中青海湖裸鯉血液生理指標變化的影響Fig.1 Effects of SLC inhibitor on blood physiological indices of Gymnocypris przewalskii exposed to fresh water or lake water

2.2 腸道排泄濃度

圖2 不同組青海湖裸鯉腸道排泄HCO－3濃度比較Fig.2 Comparison of intestinal HCO－3 excretion concentration between different groups

2.3 中腸相關基因表達

由圖3可知，湖水組裸鯉中腸SLC4A1、SLC4A4、SLC26A6基因表達量較淡水對照組均顯著上調（P＜0.05）。其中，SLC26A6基因上調較其他基因更為明顯，湖水對照組和湖水抑制組分別上調達到淡水對照組的3.6倍和5.1倍。湖水組SLC4A2基因表達量與淡水對照組無顯著差異（P＞0.05）。注射DIDS后，湖水抑制組SLC4A1基因相對于湖水對照組表達量降低；淡水抑制組SLC26A6基因表達量較淡水對照組降低。

圖3 SLC蛋白抑制劑對青海湖裸鯉中腸SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6基因相對表達量的影響Fig.3 Effects of SLC inhibitor on relative expression of SLC4A1，SLC4A2，SLC4A4，SLC26A6 genes in the mid-intestine of Gymnocypris przewalskii

3 討論

裸鯉體內血液生理指標的變化是反映其對高鹽堿環境適應性的重要指標。在本實驗中，湖水對照組裸鯉與淡水對照組相比，血液pH升高，濃度及PCO2降低。研究表明，硬骨魚類進入高鹽堿環境后，由于水體中PCO2水平較低，會促使血液中CO2向水中擴散，導致血液中的PCO2水平下降［28－29］。當魚類機體發生持續性的堿呼吸中毒時，為了緩解這種癥狀，機體會啟動酸堿調節機制，體內迅速釋放出乳酸鹽以及H＋等酸性物質，會導致短期內血液中濃度降低［30－31］。另外，高鹽堿環境中，一部分碳酸鹽可能以CO2的形式排出體外，使血液中含量隨著PCO2降低而明顯下降［32］。在本實驗中，鹽堿脅迫48 h后，裸鯉血液pH升高，PCO2降低，表明在高堿度脅迫初期，機體出現呼吸性堿中毒癥狀，這是裸鯉應對鹽堿脅迫時的生理反應。裸鯉血液中的Na＋、Ca2＋和Cl－濃度顯著升高，則是高鹽度環境下機體滲透失水，血液滲透壓升高的表現［33］。SLC家族蛋白通過調控腸道分泌，幫助裸鯉適應高鹽堿環境。裸鯉在高鹽堿環境下血液中會累積大量的，SLC家族蛋白有助于裸鯉腸道在高鹽堿環境下排泄。由于鹽堿水會引起類似海水的高滲透環境，與海水魚類似，裸鯉啟動滲透調節反應［34］，腸道分泌較多。這種現象在莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）中也有發現。羅非魚在海水環境下腸道分泌含量是淡水中的幾倍，這與參與分泌的SLC家族蛋白在羅非魚適應海水時的表達量有關［35］。還有研究也證實，海水硬骨魚的排泄與SLC蛋白相關［36－37］。在本實驗中，淡水抑制組與淡水對照組相比，雖然腸道排泄無差異，但淡水抑制組在血液中累積了更多的，這進一步驗證了DIDS會抑制SLC蛋白的活性，導致血液中的無法排出，造成在裸鯉血液中的累積。裸鯉在高鹽堿環境下會啟動SLC家族基因的高表達來提高蛋白表達，以促進腸道的排泄。鹽堿處理48 h后，裸鯉腸道SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6基因表達量均上升，且除SLC4A2基因外，湖水對照組裸鯉其余基因表達均與淡水對照組有顯著差異（P＜0.05）。腸上皮基底膜上的Na＋交換子（SLC4A2、SLC4A4）傳遞至上皮細胞，頂膜Cl－／交換子（SLC4A1、SLC26A6）分泌至腸道。裸鯉這種在鹽堿環境下通過上調SLC家族基因表達來促進多余排泄的響應方式，與海水魚應對高鹽脅迫類似，是一種滲透調節的重要方式［38－40］。