彩色蛋白凝膠試劑盒概論

何志昂 梁彩嬌 姜維

深圳市達科為生物工程有限公司 廣東 深圳 518000

引言

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法為化學聚合法。化學聚合以過硫酸銨（APS）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，后者引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。

PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續系統和不連續系統兩大類，連續系統電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續系統中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠。

研發一款蛋白電泳彩色凝膠試劑盒（BioSci? NewFlash Protein AnyKD Color PAGE Kit），需要滿足低丙烯酰胺產品，該產品使用了最新的凝膠技術降低丙烯酰胺濃度，提高凝膠速度。該凝膠試劑盒操作簡便，配膠快速安全，無TEMED試劑，無特殊氣味，且提供彩色染料染色濃縮膠.彩色上層膠，易于上樣。蛋白膠凝固快，25 min即可完成整個制膠過程。可以高電壓快速電泳，300 V恒壓25 min左右即可完成電泳，也可進行常壓電泳。適用于(10 ～ 250) kDa蛋白的分離鑒定，無須根據蛋白大小調整分離膠濃度。

1 材料和方法

1.1 設計

彩色蛋白膠分別與無色蛋白膠進行蛋白電泳測試

1.2 材料

蛋白mark（Dakewe Cat.No.8011021，8011031），NK細胞總蛋白（Dakewe 提取），電泳緩沖液（Dakewe Cat.No.8015021），蛋白上樣緩沖液（Dakewe Cat.No.8015011），蛋白染色液（Dakewe Cat.No.8019011），蛋白電泳儀（北京六一儀器 DYY-2C）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組。實驗設置5個組，分別為實驗組1（紅色凝膠），實驗組2（黃色凝膠），實驗組3（綠色凝膠），實驗組4（紫色凝膠），對照組（無色凝膠）。加入等量的Mark與總蛋白樣品，蛋白染色脫色相同時間。

1.3.2 制膠。分離膠A液和B液1∶1混勻，配膠可以使用15mL或50mL離心管配制。濃縮膠A液和B液1∶1混勻，然后加入濃縮膠體積0.4%～0.7%的濃縮膠染液（建議3mL濃縮膠加30ul濃縮膠染液，加入對應顏色染料于濃縮膠的即為對應的實驗組不加染料的即為對照組）。

向上述分離膠溶液中加入10% APS溶液（5mL加50μL），混勻后灌入模具中，分離膠溶液加至距前玻璃板頂端1.5cm或距梳齒約0.5cm，迅速小心加入水、無水乙醇或異丙醇覆蓋分離膠。待分離膠凝固（3 ～ 10 min）后，倒掉覆蓋液，用去離子水沖洗分離膠頂部數次以去除未聚合凝膠，排除頂部液體、用濾紙吸走殘留的去離子水。在上述濃縮膠溶液中加入10% APS溶液（2mL加20μL的10% APS溶液），混勻后灌入分離膠，將梳子插入凝膠內，靜置15～20 min，等待凝膠聚合。

1.3.3 上樣電泳。凝膠聚合后拔出梳子、上樣。Marker使用BioSci? ColorBand Prestained Protein Marker（Cat.No.8011011& 8011021 & 8011031），上樣緩沖液使用BioSci? SuperDrop SDS-PAGE Protein Loading Buffer 5×（Cat.No.8015011）。各組上樣相同量蛋白Mrak與總蛋白，在電泳緩沖液中實現快速電泳，電壓最高設置為300V，25min左右完成電泳，電流最大不要超過140mA，如果電流過大產熱多，可降低電壓。電泳緩沖液使用BioSci? Tris Glycine SDS Running Buffer (10×)（Cat.No.8015021）。

1.3.4 蛋白染色洗脫。電泳后，各組的蛋白凝膠放置在干凈的容器中，加入300～400mL純水搖晃清洗5分鐘，重復3次。棄去純水，加入適當體積（覆蓋凝膠為宜）的SpectBlue染色液（Cat.No.8019011）。置于搖床上染色15～30min。染色結束后，棄去染色液，加入純水洗滌去除殘留染色液，即可觀察結果。加入200mL純水進行脫色，可每隔20min更換純水進行漂洗，重復3～4次即可得到極低背景的凝膠[1]。

1.3.5 觀察拍照。觀察各組蛋白凝膠的條帶清晰度，染料是否遷移等，并拍照記錄結果。

2 結果分析

2.1 各組電泳上樣前結果如下圖

圖1中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無色蛋白凝膠制膠后的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷，濃縮膠與分離膠界限清晰，無色蛋白凝膠的濃縮膠與分離膠無明顯界限。

圖1 各組電泳上樣前結果圖

2.2 各組電泳上樣中結果

圖2中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無色蛋白凝膠上樣中的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷，濃縮膠的梳孔在電泳緩沖液中清晰可見上樣非常方便，無色蛋白凝膠的梳孔濃縮膠在電泳緩沖液中非常模糊難以分辨。

圖2 各組電泳上樣中結果圖

2.3 各組電泳中的結果如下圖

圖3中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無色蛋白凝膠電泳中的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷未褪色也為發生遷移擴散，電泳條帶與無色蛋白凝膠無差別。

圖3 各組電泳中的結果圖

2.4 各組電泳染色后的結果

圖4中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無色蛋白凝膠電泳中的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷未褪色也為發生遷移擴散，電泳條帶與無色蛋白凝膠無差別[2]。

圖4 各組電泳染色后的結果圖

3 討論

市面上的SDS-PAGE蛋白凝膠常用的濃縮膠是無色透明，在無色的電泳緩沖液中，很難看清蛋白上樣梳孔，我們研發的彩色SDS-PAGE蛋白凝膠，濃縮膠可以選擇紅、黃、綠、紫四種顏色。在無色的電泳緩沖液中，可以清晰看清蛋白上樣梳孔，極大地提高了上樣的辨識性，減少了蛋白上樣的錯誤率。此外所用的濃縮膠彩色染料是惰性染料，長期保存也不會發生顏色改變。染料鮮艷且可以非常均勻的染色濃縮膠，在電泳的過程中染料顏色沒有發生遷移也沒有顏色變淡，也沒有與Mark或蛋白結合而影響其電泳遷移。濃縮膠染料可以清晰地分界濃縮膠與分離膠方便做蛋白Westen時準確的分離切除濃縮膠。也可以根據不同的樣品選擇不同的顏色的蛋白凝膠，從顏色上更加方便的區分不同樣本的電泳的結果。