補骨脂炮制方法優選的研究

陳李東 ，朱日然，張學順，劉曉倩*

（1. 山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014；2. 老河口市疾病預防控制中心，湖北 襄陽 441800）

補骨脂，是豆科草本植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實，性溫、味辛，歸腎、脾經，有補腎固精、縮尿止帶、溫脾止瀉、固沖安胎之功效[1]。臨床廣泛用于陽萎遺精、腎虛冷瀉、腰膝冷痛、遺尿尿頻、白癜風等。近年報道補骨脂還有抗氧化、抗菌、抗骨質疏松、抗腫瘤等作用[2]。

據《雷公炮炙論》記載，補骨脂“性本大燥，毒”[3]，其久服有毒副作用，入藥前需經過炮制，降低其毒性。補骨脂炮制方法較多，主要有鹽炙法、雷公法、清炒法、鹽酒浸法、酒浸法、芝麻炒、蒸法等[4]。 其中《中國藥典》（2015年版）記錄的鹽炙法為目前常用的炮制方法[5]，但相關研究表明，該法并不是補骨脂的最佳炮制方法[6]。鑒于此，本實驗選用15種有代表性的炮制方法，分為3大類：含酒制法類、含鹽制法類、其它制法類。采用高效液相色譜法（HPLC）測定各炮制品炮制前后有效成分（補骨脂素、異補骨脂素）和有毒性成分（補骨脂酚，具有肝腎毒性[7-8]）的變化，分析各炮制品中主要成分及其含量，進而選出最佳炮制方法，為臨床應用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀；AB135-S型電子天平；超聲波提取器（昆山市超聲儀器公司）。

1.2 試藥

補骨脂藥材（批號：1804002，安國市任德興藥材有限公司）；異補骨脂素對照品（批號：R01A6F1，上海源葉公司）；補骨脂素對照品（批號：YJ07315A14，上海源葉公司）；補骨脂酚對照品（批號：YM0316SB13，上海源葉公司）；乙腈為色譜純；甲醇為分析純；紹興黃酒（浙江塔牌公司）；水（娃哈哈純凈水）；黑芝麻和面粉（購于大潤發超市）；食鹽（山東鹽業集團）；麩子（山東中醫藥大學附屬醫院）。

2 方法與結果

2.1 制備樣品

2.1.1 含鹽制法類

2.1.1.1 藥典品 100 g補骨脂藥材，加20 ml鹽水（含鹽2 g）悶潤4 h，濾過，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.1.2 鹽同炒品 50 g鹽置于炒鍋，炒至泛黃，加入100 g補骨脂藥材，翻炒至藥材崩裂或膨脹，除去鹽，放涼即得。

2.1.1.3 鹽水浸品 100 g補骨脂藥材，加20 ml鹽水（含鹽2 g）浸泡24 h，曬干，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.1.4 鹽水煮品 100 g補骨脂藥材，加100 ml鹽水（含鹽2 g）浸泡24 h，濾過，藥材置入裝有1500 ml鹽水（含鹽2 g）的容器，武火加熱煮沸，改文火煮1.5 h，晾干即得。

2.1.1.5 鹽蒸炙品 100 g補骨脂藥材，加100 ml鹽水（含鹽2 g）浸泡24 h，濾過，藥材置入裝有2000 ml鹽水（含鹽2 g）的蒸制容器，密閉蒸2 h，晾干即得。

2.1.2 含酒制法類

2.1.2.1 雷公制品 100 g補骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒浸泡12 h，濾過，再加3倍量水浸泡72 h，濾過，蒸6 h，晾干即得。

2.1.2.2 酒浸炒品 100 g補骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒浸泡24 h，濾過，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.2.3 酒焙品 100 g補骨脂藥材，加50 ml炮制用黃酒悶潤12 h，置于80 ℃烘箱，烘干，放涼即得。

2.1.2.4 鹽酒浸炒品 100 g補骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒（內溶2 g鹽），拌勻，浸泡5 h，濾過，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.3 其他制法類

2.1.3.1 清炒品 100 g補骨脂藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.3.2 芝麻焙品 100 g補骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒（內溶2 g鹽）浸泡24 h，過濾，加入100 g芝麻并與藥材拌勻，置于80 ℃烘箱中烘干，去除黑芝麻，放涼即得。

2.1.3.3 芝麻炒品 100 g黑芝麻于炒鍋內，翻炒至香氣溢出，加入100 g補骨脂藥材，繼續翻炒至藥材表面呈黑褐色或黑色，去除黑芝麻，放涼即得。

2.1.3.4 麩炒品 15 g麩皮于炒鍋內，翻炒至起煙，加入100 g補骨脂藥材，繼續翻炒至藥材表面呈黑色或黃褐色，去除麩皮，放涼即得。

2.1.3.5 面炒品 50 g面粉于炒鍋內，翻炒至微黃色，加入100 g補骨脂藥材，繼續翻炒至藥材表面呈白黑色或黃白色，去除面粉，放涼即得。

2.1.3.6 酒麩炒品 100 g補骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒浸泡12 h，濾過，藥材中加入麩皮并拌勻，置入炒鍋中，翻炒至藥材鼓起，表面呈焦黑色，去除麩皮，放涼即得。

2.2 方法學考察

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-水（B）為流動相， 梯度洗脫，程序為：0～8 min，20 %～40 % A；8～18 min，40 %～70 % A；18～21 min，70 %～85 % A；21～30 min，85 % A；30～32 min，20 % A；流速0.8 ml/min；進樣量5 μl；柱溫35 ℃；檢測波長250 nm。

2.2.2 制備對照品溶液 分別精密稱取3種對照品0.82，0.78，1.96 mg，甲醇溶解并定容于50 ml棕色量瓶，制得混合對照品溶液，補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚對照品濃度分別為16.4，15.6，39.2 μg/ml。

2.2.3 制備供試品溶液 分別取各炮制品和生品適量，粉碎后過60目篩，精密稱取各粉末1.0 g，置入索氏提取器，加適量甲醇，加熱回流法提取2 h，冷卻后轉移至250 ml量瓶，加甲醇定容，充分搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關系考察 采用“2.2.1”項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液2，5，8，12，18，30 μl，注入高效液相色譜儀測定，測得峰面積，以進樣量（X）為橫坐標、峰面積值（Y）為縱坐標，分別建立3種對照樣品的標準曲線，回歸方程是：補骨脂素Y=6569.1X-3.8357（R2=0.9999），異補骨脂素Y=7712X-4.3324（R2=1），補骨脂酚Y=18884X+3.2053（R2=1）。通過標準曲線得出，補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚進樣量范圍分別為0.033～0.492 μg，0.031～0.468 μg，0.078～1.176 μg時呈良好線性關系。

2.2.5 精密度實驗 采用“2.2.1”項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液5 μl，重復進樣6次，記錄混合對照品中補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚峰面積的RSD分別為0.80 %，0.75 %，0.31 %，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 采用“2.2.1”項下色譜條件，取“2.2.3”項下各供試品溶液5 μl，分別于0，2，4，6，12，24 h進樣檢測，記錄各共有色譜峰峰面積的RSD均小于2.12 %，表明供試品在24 h內具有良好的穩定性。

2.2.7 重復性實驗 采用“2.2.1”項下色譜條件，取“2.2.3”項下生品供試品溶液，連續進樣測定5次，記錄各共有色譜峰峰面積的RSD均小于1.93 %，表明此法具有良好的重復性。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱定含有量已知的藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密加入各對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得各成分加樣回收率分別在99.34 %～102.17 %，RSD為0.66 %～0.83 %，表明此法穩定可行。

2.3 樣品測定

采用“2.2.1”項下色譜條件，測定“2.2.3”項下各供試品溶液，記錄各供試品的HPLC色譜圖，見圖1。

圖1 各樣品的色譜圖

2.3.1 含鹽制法類炮制品與生品HPLC色譜圖比較結果 根據特征峰峰面積變化情況，對不同含鹽制法類炮制品中補骨脂素和異補骨脂素升高幅度之和變化情況進行排名：鹽蒸品>鹽水浸品>藥典品>鹽同炒品，鹽水煮品中二者含量降低。按照補骨脂酚下降幅度進行排名：鹽水煮品>鹽蒸品>鹽同炒品>藥典品>鹽水浸品。結合中藥炮制增效減毒的目的，選擇鹽蒸法作為含鹽制法類的最佳炮制方法。結果見表1。

表1 鹽制法類炮制品共有特征峰峰面積及變化情況/%

2.3.2 含酒制法類炮制品與生品HPLC色譜圖比較結果 根據特征峰峰面積變化情況，對不同含酒制法類炮制品中補骨脂素和異補骨脂素升高幅度之和變化情況進行排名：酒焙品>雷公品>酒浸品>鹽酒浸品；有效成分含量均提高。按照補骨脂酚下降幅度進行排名：酒焙品>雷公品>酒浸品>鹽酒浸品。選擇酒焙法作為含酒制法類的最佳炮制方法。結果見表2。

表2 酒制類炮制品共有特征峰峰面積及變化情況/%

2.3.3 生品與其他制法類炮制品HPLC色譜圖譜比較結果 將生品與炮制品HPLC色譜圖對比，觀察特征峰峰面積變化情況，對其他制法類炮制品中補骨脂素和異補骨脂素升高幅度之和變化情況進行排名：芝麻烘品>面炒品>清炒品>芝麻炒品，麩炒品和酒麩炒品中二者含量降低。按照補骨脂酚下降幅度進行排名：芝麻烘品>麩炒品>芝麻炒品>酒麩炒品>面炒品>清炒品。選擇芝麻烘法為其他制法類的最佳炮制方法。結果見表3。

表3 其他制法類炮制品共有特征峰峰面積及變化情況/%

2.4 指標性成分含量測定

選取鹽蒸法、酒焙法、芝麻焙法供試品溶液測定指標性成分含量，平行試驗3次，計算平均值，計算指標性成分的總含量Y值，總含量（Y）=有效成分含量值（A）+有效成分含量值（B）-毒性成分含量值（C）。結果測得酒焙品的Y值最高，確定為最佳炮制方法。結果見表4。

表4 指標性成分含量測定

3 討論

補骨脂為傳統中藥，臨床多以炮制品入藥以降低其毒副作用，2015年版《中國藥典》收載鹽炙為其主要的炮制方法。近年，有關補骨脂臨床不良反應報道越來越多[9-12]，補骨脂的用藥安全問題亟待解決，其炮制方法成為安全用藥的一個突破點。

本實驗選取15種具有代表性的補骨脂炮制方法，分成3類進行炮制。對比生品和各炮制品的HPLC色譜圖發現：（1）補骨脂炮制品未見已有成分的消失或新成分生成，炮制后化學成分只是含量的變化，而未發生質變；（2）其他制法類各炮制品的HPLC色譜圖存在明顯差異，未呈現出規律性，升降不一，推測不同輔料可能對補骨脂的化學成分含量變化影響較復雜；（3）含鹽制法類各色譜峰的變化趨勢基本一致。（4）含酒制法類中，各色譜峰的變化趨勢基本一致；（5）各炮制品中補骨脂酚的含量均降低了，因補骨脂酚具有揮發性[13]，推測其在炒、蒸等加熱的過程中揮發了[14]。因補骨脂酚具有肝、腎毒性[7-8]，其含有量下降說明炮制具有減毒的功效。

今后，本實驗將進一步研究酒焙法的炮制工藝，優化酒制炮制工藝，考察補骨脂炮制前后的藥效學變化，進一步為臨床合理安全的應用補骨脂提供依據。