應用微生物技術篩選熒光增白漿液殺菌防腐劑

周開豐，寧 靜，趙超越，吳越超

（奧仕集團有限公司，浙江 江山 324123）

熒光增白漿液其熒光增白劑本身和所使用環境友好型表面活性劑能被微生物降解，以及生產過程的開放性，使其在貯存過程中極容易腐敗變質[1]。漿液的腐敗變質，可能會導致發臭、pH變化、產生氣體、改變黏度、凝聚沉淀、染料變色等物理、化學變化，從而影響產品的質量和應用。

添加殺菌防腐劑是解決漿液腐敗變質的經濟有效方法，但殺菌防腐劑的品種繁多，每種殺菌防腐劑都有不同的殺菌機理和適合條件，如何篩選適用的、有效的殺菌防腐劑一直是行業內讓人頭痛的問題。有人曾對一種防腐劑進行過現場篩選，其方法是配制一個包裝（50 kg）的樣品，放置2個月后，打開檢查發現漿液沒有發臭，就認為此防腐劑效果好，于是就將其投入生產，結果出現大面積的變質發臭產品，給企業造成不小的經濟損失。

本研究使用微生物技術，以腐敗變質的漿液作測試菌源，利用少量的樣品同時做多種殺菌防腐劑、不同含量的殺菌防腐效果比較，以提高了篩選范圍和效率，使所篩選出的殺菌防腐劑具有高度的針對性。

1 實驗部分

1.1 試劑與原料

營養瓊脂培養基；紅四氮唑（TTC），分析純；無菌水，自制；無防腐劑熒光增白漿液，質量分數16%組合物，自制；測試菌種，含量3.58×109CFU/mL，自制。

殺菌防腐劑共19個樣品，分別由6個廠家生產，其概況見表1。

表1 19種殺菌防腐劑概況Tab 1 Overview of 19 kinds of antiseptics

1.2 儀器和設備

ф90 mm培養皿，培養皿滅菌筒，1 mL吸管，10 mL吸液管。100～500μL微量進樣器。

電熱鼓風干燥箱，101型；水套式恒溫培養箱，GHP-9160；高壓滅菌鍋，Systec V-75；菌落計數器，J-2；激光粒度分布儀，BT-9300ST；水平超凈工作臺，HS1300；數顯恒溫水浴鍋HH-4。

1.3 準備實驗

1.3.1 材料、器皿滅菌

培養皿、吸管150℃干燥滅菌150 min備用；營養瓊脂培養基、質量分數1%的TTC溶液121℃高壓滅菌15 min備用；微量進樣器、去離子水121℃高壓滅菌30 min備用。

1.3.2 測試菌種制備

從3個已腐敗變質的漿液產品中各取5 mL，裝入100 mL干凈的塑料瓶中，擰緊蓋子，充分搖勻，用菌落總數測定方法對其含菌量進行檢測[2]。經檢測含菌量為3.58×109CFU/mL。然后加71.7 mL無菌水，擰緊蓋子，充分搖勻，即得含菌量6.19×108CFU/mL）測試菌種，放入5℃冰箱保存備用。

1.3.3 無防腐劑熒光增白漿液制備

從車間取研磨漿液合格不加防腐劑的質量分數20%的漿液7.5 L，用去離子水稀釋成質量分數10%15 L，用干凈的塑料壺盛裝，擰緊蓋子放入5℃冰箱保存備用。

1.4 細菌培養溫度的確定

將無防腐劑熒光增白漿液裝入10個干凈的100 mL的塑料瓶中，兩兩一組分別放在10、20、30、36、45℃下配養1周，然后進行感官和微生物檢查。

1.5 殺菌防腐劑的篩選

1.5.1 第1次篩選

1）加入殺菌防腐劑。將無防腐劑的漿液分裝到58個50 mL干凈的塑料瓶中，每瓶50 mL，然后用100μL的微量進樣器加入殺菌防腐劑，每種殺菌防腐劑做3個使用質量分數0.05%、0.10%、0.20%的樣品，充分搖勻，同時做1個不加殺菌防腐劑的對照樣，共有58個樣。注意：每加完一種殺菌防腐劑后，應將微量進樣器徹底清洗干凈后再用或更換微量進樣器，防止殺菌防腐劑相互影響。

2）接種。在每個樣品用0.5 mL進樣器加入0.1mL測試菌種（6.19×108CFU/mL），充分搖勻，使樣品中的菌的濃度達到106CFU/mL。

3）培養。將樣品放置在(30±1)℃的培養箱中培養1周。

4）殺菌防腐效果的測定。樣品培養1周后，搖勻的樣品。無菌操作先在無菌培養皿中加入1 mL無菌水，用1 mL無菌吸管加1滴（約30 mg）樣品（1個樣1支吸管），要滴在無菌水，馬上轉動菌培養皿使樣品在水中分散開，然后用熔化冷卻到45℃加有TTC的無菌營養瓊脂培養基倒平板[3]。每個樣做2個平行樣，同時倒2個只加無菌水不加樣品的平板作空白樣。然后放入(30±1)℃的培養箱中培養1周，用菌落計數器計數每個平板中的菌落數。

1.5.2 重復篩選

為了保證篩選的可靠性和檢驗其長效殺菌防腐性能，對初步篩選出的樣品再進行重復篩選，將它們按1.5.1節中所述的步驟做重復篩選。

1.6 實際使用效果

對重復篩選得到的實際使用效果進行驗證，從2020年9月至2021年3月分別將WL-20、BRCPLUS、CP-A樣品用于生產，每個樣品連續使用2～3個月，對其使用期間的生產設施（貯槽、管道等）和產品中的細菌生長繁殖情況進行檢測，并與2020年9月前對生產設施（貯槽、管道等）和產品中的細菌生長繁殖情況檢測結果進行對比。

2 結果與討論

2.1 細菌培養溫度

漿液中細菌在不同溫度下的生長繁殖情況見表2。

表2 漿液中細菌在不同溫度下的生長繁殖Tab.2 The growth and reproduction of bacteria in the slurry at different temperature

由表2可知，溫度在20～36℃時比較適合漿液中細菌生長，說明污染漿液的細菌以中溫型細菌為主，所以殺菌防腐劑篩選時細菌培養溫度選在30℃。

2.2 第1次篩選

殺菌防腐劑主要是通過殺死微生物或使其失去生長繁殖能力來實現物料在使用工程中不發生腐敗變質，其作用機理十分復雜。一般認為，殺菌防腐劑可使微生物中的蛋白質變性，降低細胞的活性促使細菌死亡，也可使微生物的細胞遺傳基因發生變異或干擾細胞內部酶的活性使其難以生長繁殖[4]。由于殺菌防腐劑作用機理是十分復雜，所以其各有各的特點。

第1次篩選菌落計數結果見表3。

表3 第1次篩選菌落計數結果Tab 3 The first screening colony count result

各種防腐劑都有一定的作用范圍[5]。由表3可知，19種殺菌防腐劑對漿液中細菌的作用效果是不同的，有的（如SCJ-2008）在質量分數0.2%下幾乎不起作用；有的（如BB等）在質量分數0.2%下有作用，但作用不徹底；還有的（如SCJ-980）在質量分數0.05%下就能徹底控制漿液中細菌的生長繁殖。19種殺菌防腐劑中在質量分數0.2%下不能徹底控制漿液中細菌生長繁殖的有11種，只占總數的58%，通過篩選一下就將一半多不適用的樣品淘汰出局，同時獲得適用樣品的適宜的使用含量，克服了漿液殺菌防腐劑在使用上（品種和用量）的盲目性。

這樣第1次篩選，初步選WL-20、SCJ-955、SCJ-875、SCJ-980、MBS-5050、BRC-PLUS、BRC-H、CP-A等8個對漿液殺菌防腐效果較好的樣品，但MBS-5050、SCJ-875、SCJ-980是陽離子型的，暫不考慮選用，故只剩下WL-20、SCJ-955、BRC-PLUS、BRC-H、CP-A這5個樣品。

2.3 重復篩選

重復篩選結果見表4。

表4 重復篩選菌落計數結果Tab 4 Repeated screening of colony count results

從表4可知，5個樣品經過第2次篩選后有2個樣品的殺菌防腐性能有所下降，在質量分數0.2%下不能徹底控制漿液中細菌生長繁殖，說明其長效殺菌防腐性能較差，如果其被使用于漿液，在較長的保質期內存在產品被污染的風險，所以應將它們淘汰出局。通過重復篩選得到WL-20、BRC-PLUS、CP-A這3個具有長效殺菌防腐性能的熒光增白漿液殺菌防腐劑。

2.4 生產驗證

分別將WL-20、BRC-PLUS、CP-A用于生產，結果見表5；2020年9月前生產設施和產品中的細菌生長繁殖情況見表6和表7。

由表5可知，殺菌防腐劑WL-20、BRCPLUS、CP-A用于生產后，生產設施（貯槽、管道等）和產品中的都沒有檢測到細菌生長繁殖，也沒有因產品腐敗變質而被投訴。

表5 3種殺菌防腐劑的實際應用效果Tab 5 Practical application effects of 3 kinds of antiseptics

由表6和表7可知，在替換防腐劑前所生產的產品中有27%批次的產品不同程度受到細菌污染，生產設施也存在不同程度的細菌污染，并因產品腐敗變質受到客戶投訴3次（2個月）。

表6 以前317個產品留樣感官和微生物Tab 6 Sensory and microbiological samples of the previous 317 products

表7 以前生產體系中管道、貯罐微生物Tab 7 Microorganisms in pipelines and storage tanks in previous production systems

通過對比，證明用腐敗變質的漿液作測試菌源所篩選出的殺菌防腐劑WL-20、BRC-PLUS、CP-A完全能控制漿液生產設施和產品中的細菌生長繁殖。

3結論

提出的使用已經變質的熒光增白漿液作為污染細菌源，通過微生物技術針對性地篩選可以抑制熒光增白漿液特定細菌生長的殺菌防腐劑。在1個月的時間內從19種殺菌防腐劑中篩選出3種適合熒光增白漿液使用的殺菌防腐劑，篩選效率高。經過7個月1 258批次生產實際使用驗證，產品100%無豆腐腦狀沉淀、100%不發臭、100%無細菌生長繁殖，生產設施100%沒有檢測到細菌生長繁殖現象。結果表明，所篩選的3個殺菌防腐劑都能完全控制生產設施和產品中微生物的生長繁殖，提高了產品質量。所以本篩選方法可快速、穩定地對大量殺菌防腐劑樣品進行篩選，效率高、效果顯著，結果可靠，實用性強。

本方法對其它產品體系殺菌防腐劑的篩選具有一定的參考作用。