云南白藥膠囊微生物限度檢查方法學研究

張秀花，劉艷平

（菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274032）

云南白藥膠囊收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱：《中國藥典》）2020年版一部[1]，國家絕密配方，一類中藥保護品種，具有化瘀止血，活血止痛、解毒消腫的功效，臨床應用非常廣泛[2-6]，目前尚無微生物限度檢查方法的報道。本試驗在查閱近年來中和法非無菌制劑微生物限度檢查方法研究的基礎上[7-12]，參照企業提供的相關資料，采用3批樣品進行微生物限度檢查方法適用性試驗，建立了適用于云南白藥膠囊微生物限度檢查的中和法。

1 儀器與材料

1.1 樣品

云南白藥膠囊，云南白藥集團股份有限公司，批號ZLB1907，ZDA2012，ZHA1904。

1.2 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA），批號200709；胰酪大豆胨液體培養基（TSB），批號200224；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA），批號200316；沙氏葡萄糖液體培養基（SDB），批號200406；腸道菌增菌液體培養基（EE），批號180222；均由北京陸橋技術股份有限公司提供，培養基適用性檢查結果符合《中國藥典》2020年版四部規定。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10 104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50 094]，均由中國食品藥品檢定研究院提供，經鑒定合格，試驗所用菌種均為第三代。

1.4 儀器

電子天平（JE1201，上海浦春計量儀器有限公司）、脈動真空滅菌器（XG1.U，山東新華醫療器械股份有限公司）、生物安全柜（BSC-1300ⅡA2，蘇州安泰空氣技術有限公司）、細菌培養箱（KB240，德國BINDER）、霉菌培養箱（MJ-250BSH-Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司）。

1.5 試劑

中和劑：聚山梨酯80（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190821）；稀釋液：pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術股份有限公司，批號：190206）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌分別接種于TSB中，30～35 ℃培養 18～24 h；白色念珠菌接種于SDB中，20～25 ℃培養 2～3 d；黑曲霉接種于SDA中 20～25 ℃，培養 5～7 d。

取上述新鮮培養物用 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫、稀釋，制成5000～10 000 cfu/ml菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物加入 3～5 ml含 0.05 %（v/v）聚山梨酯 80 的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內，用 含 0.05 %（v/v）聚山梨酯 80的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，制成5000～10000 cfu/ml菌懸液。

2.2 樣品前處理

取樣品3批，每批4個獨立包裝，打開外包裝，將內包裝置于生物安全柜內。開啟生物安全柜及高效過濾器，當潔凈度符合要求時[13]，以無菌操作的方式，取出膠囊及保險子，混勻，備用。

2.3 供試液制備

2.3.1 常規法 取“2.2”項下供試品10 g（至少含1粒保險子），加TSB 100 ml，待囊殼、內容物及保險子全部溶解后，混勻，制成1:10供試液。取1:10供試液5 ml至5 ml TSB中，制成1:20供試液，依法制成1:50供試液。

2.3.2 中和法 取“2.2”項下供試品10 g（至少含1粒保險子），加含5 %聚山梨酯80的TSB 100 ml，待囊殼、內容物及保險子全部溶解后，混勻，制成1:10供試液。取1:10供試液5 ml至含5 %聚山梨酯80的5 ml TSB中，制成1:20的供試液，依法制成1:50供試液。

2.4 微生物計數法

2.4.1 常規法 取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項下1:10供試液中，混勻，作為試驗組；取TSB 0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項下1:10供試液中，作為供試品對照組；取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml TSB中，作為菌液對照組；以上每組各取1 ml注入平皿中，照《中國藥典》2020年版四部通則1105[14]，加入15～20 ml對應的TSA或SDA培養基，每種菌液平行制備2個平皿，測定菌液中的菌落數，計算各試驗菌回收比值。

2.4.2 稀釋法 取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項下1:20供試液中，混勻，作為試驗組；取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項的1:50供試液中，混勻，作為試驗組；取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml TSB中，作為菌液對照組，依法操作，計算各試驗菌回收比值。

2.4.3 中和法 取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.2”項下1:10供試液中，混勻，作為試驗組；取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.2”項1:20供試液中，混勻，作為試驗組；取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.2”項的1:50供試液中，混勻，作為試驗組；取“2.1”項下菌液0.1 ml，至9.9 ml TSB中，作為菌液對照組，依法操作，計算各試驗菌回收比值。

2.5 回收比值計算

采用平皿法或薄膜過濾法。

試驗組回收比值=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數，中和劑回收比值=（中和劑對照組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數[15]。

2.6 結果判斷

方法適用性試驗中，若采用平皿法或薄膜過濾法時，方法適用性試驗各試驗菌回收比值應在0.5～2范圍內，若在稀釋液或培養基中加入中和劑或滅活劑，中和劑或滅活劑對照組回收比值應在0.5～2范圍內[16]。

2.7 微生物計數方法適用性試驗

2.7.1 常規法 按“2.3.1”項下，常規法測定3批樣品5種菌株回收比值，平皿法計數結果見表1。

由表1可見，3批樣品5種菌株回收比值均未完全在0.5～2范圍內，其中，白色念珠菌在TSA和SDA中回收比值均為0，黑曲霉在TSA中回收比值為0。

表1 云南白藥膠囊微生物限度檢查方法適用性回收比值（常規法，n=3）

2.7.2 稀釋法 選取“2.7.1”項下敏感菌株，按“2.4.2”項下，采用1:20，1:50供試液進行檢查，平皿計數法結果見表2。

表2 云南白藥膠囊微生物限度檢查敏感菌回收比值（稀釋法，n=3）

由表2可見，稀釋倍數為1:50時，白色念珠菌在TSA和SDA中的回收比值均為0。稀釋倍數為1:20時，黑曲霉在TSA中回收比值小于0.5；稀釋倍數為1:50時，黑曲霉在TSA中回收比值在0.5～2范圍內。

2.7.3 中和法初篩試驗 選取“2.7.1”項下敏感菌株，“2.3.2”項下供試液，按“2.4.3”項下中和法進行試驗，平皿計數法結果見表3。

表3 云南白藥膠囊微生物限度檢查初篩試驗回收比值（中和法，n=3）

由表3可見，稀釋倍數為1:10，1:20時，黑曲霉在TSA中的回收比值均在0.5～2范圍內；稀釋倍數為1:20時，白色念珠菌在TSA和SDA中的回收比值均在0.5～2范圍內。

2.7.4 中和法 取“2.3.2”項下1:20供試液，按“2.4.3”項下中和法進行試驗，平皿計數法結果見表4。

由表4可見，稀釋倍數為1:20時，各試驗菌回收比值均在0.5 ～2范圍內；中和劑各試驗菌回收比值均在0.5 ～2范圍內。

表4 云南白藥膠囊微生物限度檢查方法適用性回收比值（中和法，n=3）

2.8 控制菌檢查

2.8.1 試驗分組

2.8.1.1 耐膽鹽革蘭陰性菌 取“2.3.2”項下1:10供試液3組，每組1 ml，分別接種至10 ml EE中，一組作為供試品組，另兩組分別加入不大于100 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，作為陽性對照組。

2.8.1.2 大腸埃希菌 取“2.3.2”項下1:10供試液兩組，每組10 ml，一組接種至100 ml TSB中，作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的大腸埃希菌，作為陽性對照組。

2.8.1.3 沙門菌 取“2.2”項下供試品兩組,每組10 g（至少含1粒保險子），分別接種至100 ml含5 %聚山梨酯80的TSB中，一組作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌，作為陽性對照組。

2.8.1.4 金黃色葡萄球菌 取“2.3.2”項下1:10供試液兩組，每組10 ml，分別接種至100 ml TSB中，一組作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌，作為陽性對照組。

2.8.1.5 銅綠假單胞菌 取“2.3.2”項下1:10供試液兩組，每組10 ml，分別接種至100 ml TSB中，一組作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的銅綠假單胞菌，作為陽性對照組。

2.8.2 控制菌檢查結果 取“2.8.1”項下各組控制菌，照《中國藥典》2020年版四部通則1106[17]依法檢查，同時以稀釋液代替供試液，其他同供試品組，作為陰性對照組，控制菌檢查結果見表5。

由表5可見，中和法3批樣品5種控制菌檢查，陽性對照組均檢出陽性菌，陰性對照組均無菌落生長，試驗結果成立。結果表明，聚山梨酯80可消除藥物抑菌性，中和法可用于云南白藥膠囊控制菌檢查。

3 討論

微生物限度檢查是藥品安全性的重要指標，微生物實驗的各項工作應在專屬的區域進行，以降低交叉污染、假陽性結果和假陰性結果出現的風險。微生物限度檢查應在不低于D級背景下的生物安全柜或B級潔凈區域內進行[13]。本試驗在D級背景下的生物安全柜內進行，避免了二次污染的風險，確保了檢驗結果的準確性、可靠性。

方法適用性試驗的本質是建立對樣品影響更小、操作率更高的方法[18]，但其本身工作量大，且存在不同實驗室方法欠佳、重復勞動過多的問題[19]，去除藥物抑菌性是其中的重點和難點[20]，因此同一品種建立統一合理有效的方法適用性試驗尤其重要。

由表1、表2可見，云南白藥膠囊對白色念珠菌的抑菌性非常強，稀釋倍數為1:50時回收比值仍為0，不適于繼續采用稀釋法。薄膜過濾法一般適用于抑菌性較強的樣品，對于抑菌性非常強的樣品，沖洗量太大，微生物易受損傷。為避免濾膜上微生物受損傷，降低微生物二次污染風險，建議采用中和法。

中和法由于稀釋液和培養基中分別加入適宜濃度的中和劑[21-23]，使樣品在稀釋或培養過程中抑菌性能得以徹底消除，適用于抑菌性強，稀釋法、薄膜過濾法無法滿足試驗要求的樣品的微生物限度檢查。

中和法為《中國藥典》2020年版四部通則收載的消除供試品抑菌活性的方法之一。聚山梨酯80為常用的中和劑，可用于鈍化、中和供試品的抑菌活性，最好在稀釋液或培養基滅菌前加入[24]。《中國藥典》2020年版四部通則9202非無菌產品微生物限度檢查指導原則中要求，如使用表面活性劑、滅活劑及中和劑，在確定其能否用于所檢樣品用量時，除應證明該試劑對所檢樣品的處理有效外，還需證明該試劑不影響樣品中可能污染的微生物的檢出（即無毒性）[25]。本試驗在稀釋液和培養基中分別加入了中和劑，中和劑各試驗菌回收比值均在0.5 ～2范圍內，確認中和劑有效和對微生物無毒性。該中和劑的加入，不影響微生物限度污染指示菌的檢出。

云南白藥膠囊為非無菌含藥材原粉的中藥制劑，按照《中國藥典》四部通則1107的要求，耐膽鹽革蘭陰性菌應小于102cfu/g。本試驗直接采用1:10供試液進行定性試驗，當1:10供試液陽性對照組檢出陽性菌時，表明該中和法可徹底消除該供試液中樣品的抑菌性，隨著稀釋倍數的增加，樣品的抑菌活性越來越弱，完全可以保障定量試驗結果的準確性。該方法操作簡單，工作效率高，適用于控制菌檢查方法適用性試驗初篩。

研究表明，云南白藥膠囊為抑菌性較強的中藥制劑，5 %聚山梨酯80可徹底消除藥物的抑菌性，適用于云南白藥膠囊微生物限度檢查。