乳清分離蛋白聚集體乳化性能及其Pickering乳液穩定性

劉 佩，陳 澄，秦新光，張海枝，胡中澤，吳 瓊，姚人勇，王學東，劉 剛,4,*

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.紐迪希亞制藥（無錫）有限公司，江蘇 無錫 214000；3.中糧米業（岳陽）有限公司，湖南 岳陽 414100；4.武漢輕工大學 湖北省農產品加工與轉化重點實驗室，湖北 武漢 430023）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）是奶酪工業的副產物，蛋白質含量在90%以上，其具有人體所需的全部必需氨基酸，營養價值極高。因此，WPI被廣泛應用于食品與藥品中，而其在食品中的作用主要是作為飲料、冰淇淋、蛋黃醬等乳化型食品的表面活性劑[1-3]。WPI與大多數蛋白質類似，對環境中pH值、溫度、鹽離子濃度的變化非常敏感，這些因素也會導致蛋白質變性聚集[4]。

近年來國內外研究學者為解決蛋白質對外界環境敏感的問題，提高蛋白質的乳化性能進行了大量研究，方法有對蛋白質進行修飾、糖基化改性、形成聚集體等，例如姚玉靜等[5]制備了磷酸化大豆分離蛋白，研究發現其溶解性、乳化能力和持水性均明顯提高；Liu Gang等[6-7]報道了WPI與乳糖通過糖基化結合后在pH 2.0的條件下加熱會使蛋白質形成納米纖維，此時蛋白質形成纖維狀聚集體，這種由糖基化WPI形成的納米纖維擁有更高的疏水性，并且制備的乳液也更穩定；王金梅[8]對大豆蛋白的熱聚集行為進行研究，通過控制pH值和加熱溫度調控大豆蛋白的聚集形態，與天然大豆蛋白相比其聚集體穩定的乳液界面蛋白含量、離子強度耐受性和pH值穩定性均有改善，而且擁有較高的熱穩定性。目前已有大量文獻表明，通過改變蛋白質存在環境可以形成不同的聚集體：在酸性條件下（pH≤2.0）進行熱處理（＞80 ℃），蛋白質的結構會發生去折疊現象，使更多的疏水基團外露，蛋白質大分子由于疏水相互作用、范德華力、分子間作用力等多種因素而發生聚集行為，導致蛋白質分子進行重新排列和交叉，從而形成了纖維狀聚集體[9-10]；在pH值靠近等電點時對蛋白質進行熱處理（＞80 ℃），由于肽鏈構象改變而造成的蛋白質高級結構去折疊，受疏水相互作用的主導并伴隨著氫鍵和二硫鍵的作用，蛋白質分子之間相互連接形成球狀聚集體[11]。

Pickering乳液是以固體顆粒直接吸附在油-水界面上形成抗聚結的穩定乳液。相較于傳統乳液，Pickering乳液除具有傳統乳液的功能特性之外，其利用固體顆粒穩定乳液不僅降低了體系的自由能，為液滴之間提供了良好的界面機械屏障，保護了乳液液滴形態，使乳液更加穩定，而且具有粒徑分布可控、低毒性、制備方法簡單等諸多優點[12]。研究表明，Pickering乳液的穩定性受離子強度、pH值、固體顆粒形狀、濃度等因素的影響。例如Mikulcová等[13]研究了pH值對羧基化纖維素納米晶形成水/油性乳液的影響，發現乳化性能主要受連續相的pH值影響；Zhu Yuqing等[14]通過改變制備條件中的pH值、離子強度、含油量，利用小麥醇溶蛋白制得一種流變性能可控的乳液凝膠。蛋白質顆粒由于具有兩親性質及營養價值成為制備食品級Pickering乳液的重要原料，且主要的研究方向集中在對蛋白質顆粒進行修飾和糖基化改性，但是對蛋白質不同聚集體的理化性質及其Pickering乳液穩定性的研究卻鮮有報道。

本實驗通過改變環境的pH值熱誘導WPI形成纖維狀聚集體和球狀聚集體，探究原蛋白與聚集體的結構特性（微觀結構、Zeta電位）和乳化特性（乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI））的差異，分析蛋白質結構的變化與乳化特性的關系。研究不同pH值、鹽離子濃度、溫度條件對Pickering乳液乳化特性和粒徑分布的影響，以期為蛋白質聚集體穩定Pickering乳液在乳飲料中的應用奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI（蛋白含量96.88%） 美國Hilmar Ingredients公司；中鏈甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）武漢遠誠科技發展有限公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20實驗室pH計、ME104E電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；C-MAG HS10恒溫磁力攪拌器、T18型高速分散儀 德國IKA工業設備集團；UV-1000紫外-可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；Zetasizer Nano-ZS馬爾文激光粒度儀、Mastersizer 3000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；CX40光學顯微鏡 舜宇光學科技（集團）有限公司；Libra 200MC型透射電子顯微鏡 蔡司光學儀器（上海）國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI聚集體的制備

用超純水配制質量濃度5 mg/mL的WPI溶液，室溫下磁力攪拌2 h使其充分溶解。取3 份上述WPI溶液，記為1號、2號、3號。將1號和2號溶液調至pH 7.0，3號溶液調至pH 2.0。然后，將1號溶液置于室溫下磁力攪拌12 h，2號和3號溶液置于85 ℃油浴鍋中加熱攪拌12 h。2號和3號取出后立即冷卻至室溫。最后將三者置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 WPI纖維狀聚集體和球狀聚集體的形貌表征

分別用pH 2.0、7.0的去離子水稀釋WPI溶液到質量濃度為0.5 mg/mL。移取少量樣品至銅網上吸附20 min，使用濾紙對銅網進行干燥處理，運用透射電鏡在100 kV電壓下觀察并拍照。

1.3.3 Zeta電位的測定

分別調節1.3.1節中制得的WPI、纖維狀聚集體和球狀聚集體溶液至pH 2.0～7.0，使用Malvern Nano-ZS型激光粒度儀測定Zeta電位。

1.3.4 Pickering乳液的制備及其EAI的測定

參考Pearce[15]與崔珊珊[16]等的方法測定EAI。以WPI溶液作為水相，MCT作為油相，將水相和油相以質量比1∶1混合，使用高速分散機于室溫、20 000 r/min處理1 min制得乳液。室溫靜置2 h使蛋白顆粒充分吸附到油水界面上，取底部液體10 μL，并用質量濃度為1 mg/mL的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋至1 mL。充分混勻后，利用紫外-可見分光光度計測其500 nm波長處的吸光度。乳化性用EAI表示，其計算公式如下：

式中：T=2.303；A500nm為乳液在波長500 nm處的吸光度；C為蛋白質質量濃度/（g/mL）；φ為油相所占體積分數（φ=1/2）；n為稀釋倍數（n=100）。

1.3.4.1 pH值對WPI及其聚集體乳化性能的影響

分別將3 種WPI溶液調至pH 4.0～9.0，以上述不同pH值梯度蛋白溶液制備Pickering乳液并測定EAI。

1.3.4.2 鹽離子濃度對WPI及其聚集體乳化性能的影響

取3 種WPI溶液分別調至pH 7.0，加入NaCl使其鹽離子濃度分別為0、50、100 mmol/L，以上述不同鹽離子蛋白濃度溶液制備Pickering乳液并測定EAI。

1.3.5 Pickering乳液的微觀結構

取Pickering乳液乳化層少量，稀釋一定的倍數，分散均勻后取10 μL分散液進行制片，在光學顯微鏡下觀察乳液的微觀形貌并拍照分析。

1.3.6 Pickering乳液的粒徑分析

使用Malvern Mastersizer 3000激光粒度儀分別測定Pickering乳液的粒徑大小及其粒徑分布情況（測試時取乳化層）。參數為：顆粒吸收率為0.001，顆粒折射率為1.450，分散劑折射率為1.330，密度為0.945。

1.3.7 熱穩定性分析

取3 種WPI溶液，并分別調至pH 7.0，分別置于室溫（25 ℃）、65、85 ℃和105 ℃加熱15 min，取出冷卻至室溫后，再對Pickering乳液進行粒徑分析。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 WPI纖維狀聚集體和球狀聚集體的形貌表征

使用透射電子顯微鏡觀察在不同pH值下制備的WPI聚集體的微觀形貌，結果如圖1所示。在pH 2.0時，WPI溶液經85 ℃加熱處理12 h，WPI顆粒的形貌呈纖維狀聚集（圖1A），這與朱連昌[17]的報道較為一致。對于蛋白質纖維狀聚集的作用機理已有廣泛報道，普遍認為蛋白質去折疊過程是形成纖維狀聚集的關鍵[18]。黃穎等[19]報道了β-乳球蛋白纖維狀聚集體產生過程中的形貌變化，發現加熱初期β-乳球蛋白粒子分散性更好，而加熱2 h后蛋白質開始呈纖維狀聚集。而在pH 7.0時，WPI經85 ℃加熱處理12 h后呈現球狀聚集（圖1B），與圖1A形成完全不同的形貌。這2 種聚集體的形成主要是由于不同酸熱條件，蛋白質分子間發生疏水相互作用以及形成二硫鍵。不僅這2 種聚集體的形貌迥異，而且會表現出截然不同的界面性質[20]。

圖1 WPI聚集體的透射電鏡圖像Fig.1 TEM pictures of WPI and its aggregates

2.2 WPI不同聚集體Zeta電位隨pH值的變化情況

根據圖2所示，2 種聚集體的Zeta電位隨pH值的變化趨勢與WPI相似，總體呈現隨pH值的增大而減小的趨勢，且Zeta電位均存在顯著差異（P＜0.05）。同時，可以看出2 種聚集體的等電點相較于WPI均發生了右移，其中纖維狀聚集體的等電點右移更為明顯。在蛋白質等電點附近（pH 5.0）時，WPI聚集體的Zeta電位絕對值明顯小于原蛋白，這說明蛋白表面電荷的減少，造成這一現象的原因可能是在蛋白質聚集體形成的過程中，蛋白表面帶電的氨基酸殘基內收，從而降低了WPI在等電點附近的攜帶電荷的能力[21-22]。

圖2 WPI、纖維狀聚集體及球狀聚集體的Zeta電位分析Fig.2 Zeta-potential of WPI, fibrous aggregates, and spherical aggregates

2.3 pH值對WPI聚集體乳化性能及其Pickering乳液的影響

2.3.1 pH值對WPI及其聚集體乳化性能的影響

EAI是蛋白質吸附到界面能力的量度[23-24]，是直接反映乳液性能的常用指標之一。從圖3可知，pH值對WPI及其聚集體的EAI影響非常顯著，整體上EAI隨著pH值的增加呈現先減小后增大的趨勢，且EAI均存在顯著差異（P＜0.05）。在pH 5.0時，WPI及其聚集體的EAI值最低，這可能是因為蛋白質在等電點附近時，蛋白質的表面電荷幾乎為0，溶解性最差，顆粒間的排斥作用減弱，吸附在乳液油水界面上的蛋白質最少，因此此時EAI值最低[25-26]。而在pH 4.0的條件下，WPI纖維狀聚集體的EAI顯著高于WPI和球狀聚集體，達到（21.62±0.56）m2/g，這與2.2節中pH 4.0時纖維狀聚集體的Zeta電位絕對值較大相一致，說明pH 4.0時纖維狀聚集體的表面負載有更多的電荷，蛋白顆粒間排斥作用增強，吸附在油水界面上的蛋白質增加，導致此時EAI值增大。

圖3 pH值對WPI及其聚集體EAI的影響Fig.3 Effect of pH on EAI of WPI and its aggregates

2.3.2 不同pH值條件下Pickering乳液的微觀結構

如圖4所示，WPI原蛋白所制備的Pickering乳液對pH值的變化尤為敏感，乳液結構不穩定，乳滴形狀不均一且易破乳。但2 種聚集體制備的Pickering乳液具有穩定的乳液結構，均可形成大小較為均一的球狀液滴，這可能是因為纖維狀聚集體與球狀聚集體的形成增強了蛋白表面的疏水性，這樣的顆粒在油-水界面上的吸附性更強，毛細管力更大，所形成的Pickering乳液液滴均一，穩定性也越好[27]。

圖4 不同pH值條件下Pickering乳液微觀結構Fig.4 Microstructures of Pickering emulsions under different pH conditions

2.4 鹽離子濃度對WPI聚集體乳化性能及其Pickering乳液粒徑的影響

2.4.1 鹽離子濃度對WPI及其聚集體乳化性能的影響

如圖5所示，WPI和球狀聚集體的EAI均呈現先增大后減小的趨勢，這表明低濃度的鹽離子有助于提高WPI及其球狀聚集體的乳化活性，這可能是因為低濃度鹽離子存在時，水的結構發生改變，蛋白溶解度降低但不至于聚集[28]，進而加強了其乳化性能；當NaCl濃度達到100 mmol/L時，蛋白質的EAI相較于0 mmol/L時變化不大，可能是因為過高的NaCl濃度使蛋白質表面電位降低，鹽離子會導致蛋白質之間的交聯，同時產生靜電屏蔽作用。值得注意的是，纖維狀聚集體乳化性能受鹽離子濃度影響不顯著（P＞0.05），在0、50、100 mmol/L的條件下分別為（18.02±1.08）、（18.33±1.14）、（18.00±0.83）m2/g，原因可能是在形成纖維狀聚集體的過程中，帶電的氨基酸殘基的空間位點發生了改變，使其乳化性能不易受鹽離子濃度影響。

圖5 NaCl濃度對WPI及其聚集體EAI的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on E AI of WPI and its aggregates

2.4.2 鹽離子濃度對Pickering乳液粒徑的影響

圖6A～D反映WPI及其聚集體穩定Pickering乳液的粒徑變化情況。由圖6B、D可以看出，在0、50、100 mmol/L的鹽離子濃度下，纖維狀聚集體穩定的Pickering乳液，其粒徑分布圖的3 條曲線幾乎重合，乳液的平均粒徑也幾乎不受鹽離子濃度影響，顯示了粒徑受鹽離子濃度影響不顯著（P＞0.05），這說明纖維狀聚集體穩定的Pickering乳液有良好的鹽離子耐受性。這也與纖維狀聚集體良好的乳化性能有關，由于纖維狀聚集體在兩相界面上的吸附能力對鹽離子濃度變化并不敏感，造成了其Pickering乳液具有較好的穩定性[29]。由圖6A、C和D可知，鹽離子濃度對WPI與球狀聚集體穩定的Pickering乳液的平均粒徑影響顯著（P＜0.05），乳液粒徑均會在NaCl濃度50 mmol/L時減小，在NaCl濃度100 mmol/L時增大，這可能是由于鹽離子的加入起到靜電屏蔽的作用，增加了蛋白顆粒的表面疏水性，而低濃度的鹽離子又不至于使其聚集，從而小幅度地降低了乳液粒徑。同時，球狀聚集體本身的疏水性要強于WPI，當乳液中鹽離子濃度到達100 mmol/L后，其受靜電屏蔽的影響大于原蛋白，從而導致了乳液平均粒徑的增幅較大[30]。

根據圖6A、B、C對比可知，鹽離子的添加引起纖維狀聚集體和球狀聚集體穩定Pickering乳液的粒徑分布曲線的峰強變強，乳液更加均一，這可能是因為添加了鹽離子后，水的結構和分子排列發生改變、顆粒在界面上的分布更有序。

圖6 NaCl濃度對Pickering乳液粒徑分布的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration on particle size distribution of Pickering emulsions

2.5 熱穩定性分析

在食品生產加工過程中不可避免會進行熱處理。因此，必須研究溫度對蛋白質乳液體系的影響，而乳液的粒徑則是評判乳液性質的重要參數。由圖7可以看出，經過熱處理后，WPI及其聚集體所制得的Pickering乳液粒徑分布良好。圖7A顯示經過熱處理后WPI穩定的Pickering乳液的峰強增強，說明熱處理提高了其穩定性；圖7B顯示纖維狀聚集體穩定的Pickering乳液峰強也有增強的趨勢，但是在65 ℃處理后峰寬加大，峰強減小，這是因為WPI纖維狀聚集體的蛋白分子質量大，較低的加熱溫度便足以使其分子之間發生聚集，從而使乳液平均粒徑增大、均一性下降；圖7C顯示球狀聚集體穩定的Pickering乳液在加熱處理后峰強均減小，特別是在85 ℃時不僅峰強下降程度更深，峰寬也加大，這說明在85 ℃處理后，乳液的粒徑差別較大、且分布不均勻。

圖7 處理溫度對Pickering乳液粒徑分布的影響Fig.7 Effect of different treatment temperatures on particle size distribution of Pickering emulsions

從圖7D可知，WPI及其聚集體在加熱處理后其平均粒徑均呈現先減小后增大的趨勢，這可能是因為較低溫度（65 ℃）的熱處理使Pickering乳液的流動性增強、蛋白表面攜帶了正負電荷的基團發生中和，使顆粒表面變得柔順，而當處理溫度升高后（85、105 ℃），蛋白顆粒發生聚集，顆粒分散性有所下降，乳液的平均粒徑也增大了[31]。并且原蛋白與纖維狀聚集體穩定的Pickering乳液在105 ℃處理后發生大量聚集，平均粒徑分別增至（55.5±0.76）μm與（45.2±1.02） μm。不僅如此，對不同處理溫度后的Pickering乳液進行倒置宏觀觀察，纖維狀聚集體穩定的Pickering乳液在105 ℃處理后，由于纖維狀聚集體的交聯使Pickering乳液出現明顯的凝膠化，而球狀聚集體穩定的Pickering乳液在整個過程中其平均粒徑變化較小，加熱處理后仍舊保持良好的流動性。雖然球狀聚集體穩定的Pickering乳液的粒徑分布情況并不理想，但其在熱處理后平均粒徑變化最小，且仍保持了良好的流動性，并未有明顯凝膠結構的生成，所以球狀聚集體穩定的Pickering乳液是原蛋白、纖維狀聚集體、球狀聚集體中穩定性最佳的。

3 結 論

本實驗分別在pH 2.0和pH 7.0熱處理制備WPI纖維狀聚集體和球狀聚集體，這2 種聚集體在形貌上具有截然不同的特點，表現出其不同的乳化性能和熱穩定性。在pH 2.0～7.0時，WPI聚集體Zeta電位的變化趨勢與原蛋白相似，均由攜帶正電荷逐漸變為帶負電荷。在不同的pH值環境下，兩種聚集體比原蛋白具有更好的乳化性能，并且由聚集體穩定的Pickering乳液在較廣泛的pH值范圍均能保持液滴的形態。在不同鹽離子濃度下，纖維狀聚集體的乳化性能幾乎不受影響，并且所穩定的Pickering乳液也非常穩定。最后對WPI及其聚集體所穩定的Pickering乳液進行熱穩定性分析，由聚集體穩定的Pickering乳液相較于WPI能夠更好地抵御溫度的變化。因此，WPI聚集體相較于WPI在外部環境變化中擁有更好的乳化性能以及穩定性，蛋白質聚集體的乳化與液滴結構的穩定性、耐溫性等優勢有望應用于食品和飲料等研究領域。