辛烯基琥珀酸脫支淀粉-不同構型風味物質包合物的制備及結構表征

馮 濤，胡中山，曾小蘭，張 鈺*，宋詩清，姚凌云，孫 敏，徐志民

（1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海應用技術大學技術轉移中心，上海 200235；3.路易斯安那州立大學營養與食品科學學院，美國 路易斯安那 巴吞魯日 LA 70803）

食品風味物質種類繁多，含量少、穩定性差，難溶于水，分子結構具有高度特異性。風味物質根據結構一般可分為3 種，包括線性風味物質、環狀風味物質和立體狀風味物質。在實際生產過程中，經常會因風味物質的不穩定而降低了芳香化合物的強度或產生異味成分等導致食品整體風味的改變[1]。為有效地解決這些問題，可將風味物質以分子包合提高食品的可口性和風味穩定性[2-5]。

脫支淀粉（debranched starch，DBS）是一種經過酶促改性的低聚合度的親水性線性多糖[6]。DBS被廣泛認為是一種潛在的載有活性成分[7]、藥物[8]的包埋壁材[9]和α-淀粉酶抑制劑[10]以及水凝膠增強材料[11-12]。但是DBS對風味物質的包埋率不高。為了提高淀粉基類壁材的包埋能力，需對淀粉進行改性。由蠟質玉米原淀粉通過普魯蘭酶水解生成DBS[13]，再與食品級的辛烯基琥珀酸（octenyl succinic acid，OSA）發生酯化反應，得到能與一系列具有疏水性基團的化合物形成絡合物OSADBS[14]。利用OSA-DBS內部疏水外部親水的特性包埋難溶于水的不同構型的風味物質。Chang Ranran等[15]研制出一種新型的用于裝載和運輸活性成分的OSA-DBS，在食品和生物醫藥行業具有潛在的應用價值。Cheuk等[16]利用OSA-DBS包埋輔酶Q10以提高其生物活性并實現靶向釋放。Kreuter[17]和Singh等[18]利用OSA-DBS包埋藥物，很大程度上增加了其生物利用率。將蠟質玉米原淀粉通過采用普魯蘭酶水解多糖中的α-1,6-糖苷鍵之后得到DBS，此法高效、環保且簡單[19]。

為了探究OSA-DBS包埋不同構型的風味物質的包合性質，本實驗先利用OSA將DBS改性，制備成具有雙親性的壁材，后對食品工業領域常用的3 類不同構型的風味物質進行包埋，以期為OSA-DBS包埋其他風味物質提供一定參考依據，擴大OSA-DBS在食品中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟質玉米淀粉 宜瑞安中國有限公司。

辛烯基琥珀酸酐（分析純） 東京化成工業株式會社；普魯蘭酶（1 000 ASPU/g，分析純） 上海源葉生物科技有限公司；正己醛、正庚醛、正辛醛、γ-己內酯、γ-庚內酯、γ-辛內酯、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純） 上海阿拉丁試劑有限公司；一水合檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團（上海）試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FD-2冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；Q5000 IR熱重分析儀 美國沃特斯公司；VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度分布儀 馬爾文儀器（中國）有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本高新那珂事業所；6890氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OSA-DBS的制備

利用蠟質玉米淀粉通過普魯蘭酶水解成DBS，后與辛烯基琥珀酸酐發生酯化反應生成OSA-DBS，其中部分實驗操作參考Sun Qingjie[20]和Liu Zhiqiang[21]等方法。

1.3.1.1 DBS的制備

采用分析天平準確稱取60 g烘干的蠟質玉米淀粉，邊溶解邊攪拌加入到預先制備好的400 mL Na2HPO4-一水合檸檬酸緩沖溶液中，持續攪拌并加熱至98 ℃，保持40 min使淀粉糊化并呈現出透明的狀態，隨后降溫至50 ℃后緩慢滴加0.9 g酶活力為1 000 U/g的普魯蘭酶，保持反應狀態8 h后，快速離心（1 000 r/min、2 min），去除底部沉淀（未被完全水解的淀粉和雜質），收集上清液，然后水浴加熱至90 ℃高溫滅酶活30 min以終止反應，將溶液倒平板，先預冷凍再冷凍干燥得DBS粉末。

1.3.1.2 OSA-DBS的制備

取DBS 10 g溶解在200 mL蒸餾水中，加入攪拌子于120 ℃的油浴鍋中加熱40 min澄清透明后轉移至56 ℃的水浴鍋中，用5% NaOH溶液調節pH 8.0～9.0，將2.5 g OSA提前分散在2～5 mL無水乙醇中，然后在1.5 h內緩慢滴加到DBS溶液中。由于酯化反應時刻都在發生，所以需要每隔2～5 min滴加適量的NaOH溶液以保證反應在最佳pH值環境范圍內進行。反應時間7 h，之后利用5% HCl溶液調節pH 6.5以終止反應。再加入DBS溶液3～5 倍體積的無水乙醇（＞99.7%）溶液先醇沉，后水洗，再冷凍干燥得OSA-DBS粉末。

1.3.1.3 OSA-DBS微米粒子的制備

部分參考Payyappilly等[22]的關于制備辛烯基琥珀酸淀粉酯微米顆粒的實驗。配制濃度為0.1 mol/L的KH2PO4溶液和Na2HPO4溶液，后稱取20 g OSA-DBS粉末溶解在2 L緩沖溶液中，配制成質量濃度為10 mg/mL的復合物溶液，于35 ℃的水浴鍋中緩慢攪拌7 h，反應結束后加入3～5 倍體積的無水乙醇醇沉，經水洗、冷凍干燥得微米粒子。

1.3.2 OSA-DBS-不同構型風味物質包合物和混合物的制備

準確稱取10 mg三類不同構型的風味物質（線性：正己醛、正庚醛、正辛醛；環狀：γ-己內酯、γ-庚內酯、γ-辛內酯；立體狀：2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪），分別分散在2 mL無水乙醇中，配制成5 mg/mL的風味物質乙醇溶液。稱取OSA-DBS 1 g，分散在蒸餾水中，配制成10 mg/mL的OSA-DBS溶液，將風味物質向OSA-DBS溶液中緩慢滴加后，置于30 ℃的恒溫水浴鍋中，攪拌7 h，后倒平板冷凍干燥72 h，得到不同構型風味物質包合物。其中，OSA-DBS-不同構型風味物質混合物的制備除攪拌時間為0.5 h，其他操作過程與包合物的制備相同。

1.3.3 包埋率和載藥量的測定

1.3.3.1 包埋率的測定

采用氣相色譜法測定。氫火焰檢測器，HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為高純氮，載氣流速2 mL/min；進樣口和檢測器溫度分別為160、200 ℃，分流比設定為30∶1。升溫程序：90 ℃保持1 min后以10 ℃/min的速率升溫至110 ℃并保持5 min，再以20 ℃/min升溫至130 ℃并維持15 min，最后以20 ℃/min升溫至160 ℃并維持5 min；進樣量為5 μL。

1.3.3.2 標準曲線方程的建立

分別稱量1 g不同構型風味物質包合物溶解于200 mL的無水乙醇中以制備母液，攪拌使其均勻分散，轉入容量瓶中定容，得到1 000 μg/mL的風味物質包合物無水乙醇溶液。分散均勻后用移液槍吸取1 mL母液于10 mL容量瓶中無水乙醇定容，依次取其母液配制不同質量濃度梯度的不同構型風味物質無水乙醇溶液，即50、20、10、5、1 μg/mL的風味物質標準溶液。每次吸取5 μL，質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制風味物質標準曲線。

1.3.3.3 包合物中游離的風味物質總量

稱量0.01 g OSA-DBS-風味物質包合物配制成1 mg/mL的包合物無水乙醇溶液。超聲10 min后靜置，后取上清液測定其風味物質的峰面積，計算對應包合物中游離的風味物質含量。

1.3.3.4 包合物中風味物質總量

稱量0.01 g不同風味物質包合物微米顆粒配制成1 mg/mL的溶液。攪拌后高速離心（15 000 r/min、20 min）使包合物微米顆粒完全破壞，此時，包合物中風味物質完全釋放。離心取上清液，測定出微膠囊的風味物質峰面積，通過計算得到微膠囊風味物質總量。

1.3.3.5 包埋率和載藥量計算

1.3.4 OSA-DBS-不同構型風味物質包合物的表征

1.3.4.1 不同構型風味物質包合物平均粒徑、多分散系數（polydispersity indices，PDI）和Zeta電位的測定

通過Zetasizer Nano ZS型激光粒度分布儀進行測定。測定前，先將樣品配制成均勻分散的體系，所有樣品需過0.45 μm的微孔濾膜，以便除去掉大顆粒的聚集體。將樣品溶液于室溫條件下測定納米乳液的Zeta電位。樣品設置測定3 次取其平均值[13]。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜測定

測定波數范圍為4 000～500 cm－1，分辨率為2 cm－1，檢測器為DLATGS。

1.3.4.3 熱重分析

以高溫質量損失反映風味物質包埋效果。每次裝樣之前用乙醇將樣品盤灼燒5 s以除去盤中的雜質，然后放進儀器進行矯正之后，再稱取3～5 mg的樣品于坩堝中，置于熱重分析儀系統。設置程序氮氣流量20 mL/min，升溫速率10 ℃/min，樣品升溫范圍30～500 ℃。

1.3.4.4 掃描電子顯微鏡觀察

向0.1 mg樣品中加入10 mL超純水，超聲處理10 min均與分散后，取燒杯中間處的1 滴樣品于貼有導電膠的樣品臺上，將樣品進行噴金處理，然后在電流3 mA、加速電壓15 kV條件下調節到最適宜的倍數觀察微觀形貌。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 包合物包埋參數及粒徑的測定結果

由表1可知，OSA-DBS作為壁材包埋不同構型的風味物質的包埋率和載藥量均很高，其中立體狀風味物質最高，并且OSA-DBS-2,3,5,6-四甲基吡嗪的包埋率78.50%和載藥量21.41%在所有包合物中均達到最大。在同一構型中，風味物質包合物的包埋率和載藥量隨著碳原子數呈現上升趨勢；在不同構型中，風味物質包合物的包埋率和載藥量大小關系為：立體狀風味物質＞環狀風味物質＞線性風味物質。Brisson等[23]發現正己醛被包埋進了一個每圈有6 個脫水葡萄糖單元螺旋。Bail等[24]研究證明2,5-二甲基吡嗪和OSA-DBS包合晶型特征屬于V8型。Conde-Petit等[25]在食品模型中研究淀粉包埋風味物質的結構特性時發現，立體狀構型的風味物質容易被包埋進淀粉的螺旋結構中。

表1 風味物質包合物的包埋率和載藥量Table 1Encapsulation rates and drug-loading amounts of inclusion complexes

Zeta電位是反映不同構型風味物質穩定性的重要指標，通常螺旋體系附近由于抗衡離子的屏蔽作用使得離子濃度降低，進而Zeta電位值偏低。一般情況下，30＜|Zeta電位|≤40時，包埋體系表現出較好的穩定性；20＜|Zeta電位|≤30時，包埋體系穩定性一般；0≤|Zeta電位|≤20時，包埋體系穩定性較差。由此可知，同一構型中，低分子質量（C6）的風味物質穩定性低于高分子質量（C8）；不同構型中，立體狀風味物質包合物Zeta電位最穩定，不同構型風味物質包合物穩定性從高到低順序為立體＞環狀＞線性。

納米粒度儀測得不同構型粒徑關系：立體風味物質＞環狀風味物質＞線性風味物質，其中線性風味物質包合物最低為90.09 nm，最高為92.53 nm；環狀風味物質包合物最低為104.72 nm，最高為110.71 nm；立體風味物質包合物最低為160.46 nm，最高為176.04 nm。結合Zeta電位發現，風味物質包合物粒徑越大，包合體系穩定性相對越高。PDI表示粒徑的均一性，其值越小表示包合物小球粒子大小分布集中，均一性越好。表中線性風味物質包合物PDI值偏低，其最低為0.056，說明線性包合物粒徑范圍窄且分布均一。立體狀風味物質包合物偏高，其最高為0.85，表明粒徑分布范圍寬，大顆粒突出。造成這種現象的原因可能是與包合物所形成的空間結構有關，即線性包合物的空間結構比較小，而且相互之間的差異較小，而立體狀包合物的空間結構大，相互之間的差異較大。綜上，立體狀風味物質包合物的包埋率和載藥量更高，且包合物體系更加穩定，更適合利用OSADBS包埋并在實際中應用。

2.2 傅里葉紅外光譜分析

由圖1a可知，3 種線性醛類風味物質光譜中，3 390 cm－1和2 934 cm－1的峰值分別是O—H和C—H的伸縮振動。1 020 cm－1和1 160 cm－1兩處是由C—O引起，1 180 cm－1處的風味物質C—O—C的伸縮振動峰[26]。在風味物質混合物中，這幾處的特征吸收峰依然存在，紅外吸收光譜表現出風味物質和壁材的疊加。除位于1 180 cm－1處的C—O—C伸縮振動峰外，大多數風味物質的吸收峰都被覆蓋。除了位于1 020 cm－1的C—O伸縮外，3 種線性風味物質的紅外光譜基本相同。在風味物質包合物中，3 種線性風味物質的特征峰消失，以此說明3 種線性風味物質都被包埋進OSA-DBS螺旋結構中，風味物質的特征峰才出現了屏蔽，說明包合物的形成的紅外光譜基本相同，除了位于1 020 cm－1的C—O伸縮。Cheng Weiwei等[27]利用淀粉包埋磷脂酰膽堿的包埋實驗中也得出了同樣的結論。

在圖1b中，風味物質分別在1 795 cm－1和1 360 cm－1處由于C＝O和C—O—C而出現伸縮振動峰，同時在3 010 cm－1和2 950 cm－1處有O—H和C—H引起的伸縮振動峰，且相對于線性結構的風味物質，由于環狀風味物質含有—COOR導致風味物質紅外圖譜出現了一定的藍移。同樣，在環狀風味物質混合物中，由于壁材對風味物質的覆蓋作用導致風味物質的吸收峰發生了很大程度上的減弱。包合物中風味物質的特征峰消失，可知風味物質成功包埋進了螺旋構型中。

圖1c立體狀風味物質紅外圖譜中，風味物質包埋物在3 009 cm－1和2 980 cm－1處有C—H引起的伸縮振動峰，且在1 508 cm－1處出現吡嗪環的吸收振動峰。在風味物質混合物中，這3 處的特征吸收峰依然存在，說明混合物的紅外圖譜是壁材和風味物質的簡單疊加，在風味物質包合物中，風味物質的特征峰消失，表明風味物質被包埋進了OSA-DBS螺旋結構中。

圖1 線性（a）、環狀（b）、立體狀（c）風味物質及其混合物、包合物的傅里葉紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of linear (a), circular (b) and three-dimensional (c)flavor substances as well as their physical mixtures and inclusion complexes with OSA-DBS

2.3 熱重分析

由圖2可知，包合物和混合物以及壁材在進行加熱的過程中，0～100 ℃加熱階段主要是樣品中水分加熱蒸發的損失，溫度達到200 ℃時才開始出現明顯的質量損失，一方面是因為樣品的干燥非常徹底，水分含量很低，沒有因為水分散失而出現明顯變化；另一方面是因為在200 ℃開始，壁材因為高溫灼燒開始發生裂解，樣品盤總質量出現大幅度的下降。在250～350 ℃過程中，壁材和芯材均會出現嚴重質量損失，且包合物在這個溫度區間質量損失大大下降，可能是因為壁材和芯材都發生了熱裂解導致[28]。

圖2 線性（a）、環狀（b）、立體狀（c）風味物質的混合物和包合物以及OSA-DSB的熱重分析Fig.2 TGA curves of linear (a), circular (b), and three-dimensional (c)flavor substances as well as their physical mixtures and inclusion complexes with OSA-DSB

在圖2a中，正己醛、正庚醛、正辛醛3 種線性風味物質混合物在200～350 ℃之間發生嚴重的質量損失，占總質量的61.9%，而包合物在此階段質量損失溫度范圍在247～360 ℃，損失質量只占總質量的33%，且損失溫度相對于混合物有滯后。包合物相比于混合物，穩定性顯著提高，由此說明穩定效果：正己醛＞正辛醛＞正庚醛。

在圖2b中，γ-己內酯、γ-庚內酯、γ-辛內酯3 種環狀風味物質包合物主要質量損失出現在250～330 ℃，且質量損失占樣品盤上面總質量的20%左右。而3 種風味物質混合物在200～350 ℃之間，混合物的質量損失約為56%。2,3,5,6-四甲基吡嗪包合物的質量損失曲線和其混合物的靠近，說明2,3,5,6-四甲基吡嗪包合物的外殼上有部分風味物質黏連。通過熱重實驗得出包合作用增加了風味物質的穩定性，且穩定效果：γ-庚內酯＞γ-己內酯＞γ-辛內酯。

在圖2c中，混合物的質量損失有2 個階段，第1階段是主要是風味物質的損失發生在207～275 ℃之間，第2階段主要是淀粉的分解280～350 ℃。2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪包合物的質量損失發生在215～350 ℃之間，與其混合物的質量損失階段207～345 ℃很接近，可能是因為壁材表面附著有風味物質。其中2,5-二甲基吡嗪包合物的質量損失曲線相對于2,3,5-三甲基吡嗪稍有靠后，表明2,5-二甲基吡嗪包合物穩定性更高。從曲線可以得出穩定效果：2,5-二甲基吡嗪＞2,3,5-三甲基吡嗪＞2,3,5,6-四甲基吡嗪。

3 種同一構型不同碳原子數的風味物質包合物的熱重分析曲線走勢基本一致，說明了同一構型包合物之間的差別不大，且包埋后的風味物質熱穩定性和芯材的熱穩定性明顯高于混合物。但是，不同構型的風味物質之間，線性結構的風味物質在255 ℃以后發生明顯質量損失，環狀結構風味物質的質量嚴重損失是從265 ℃開始的，立體狀結構風味物質的明顯質量損失是在270 ℃，因此推測3 種構型風味物質包合物熱穩定性：立體狀風味包合物＞環狀風味包合物＞線性風味包合物。

2.4 掃描電子顯微鏡觀察

從圖3可以看出，被包埋的風味物質整體顆粒表面比較光滑，顆粒可能較為完整，大多近似為球形和橢球形。這可能是由于普魯蘭酶催化水解支鏈淀粉中的α-1,6糖苷鍵，使支鏈淀粉轉變成疏水的線性短鏈葡聚糖，經過與親水的辛烯基琥珀酸酐酯化之后，得到雙親性螺旋結構分子分別包埋線性、環狀和立體狀的風味物質，使得極性基團和非極性基團在超聲作用的條件下形成更加牢固的膜，與風味物質緊緊的包覆在一起。此外，同一構型的風味物質包合物，隨著碳原子數增加，形成的包合物顆粒稍微偏大。

圖3 OSA-DBS-不同構型風味物質包合物的掃描電子顯微鏡圖Fig.3 SEM graphs of inclusion complexes between flavor substances and OSA-DBS

3 結 論

本實驗主要利用OSA-DBS包埋線性（正己醛、正庚醛、正辛醛）、環狀（γ-己內酯、γ-庚內酯、γ-辛內酯）、立體狀（2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪）3 種構型的風味物質，并對其進行結構表征。結果表明，風味物質包合物制備成功，且熱穩定性得到提高，熱穩定性關系：線性＜環狀＜立體狀。包合物可能是球狀，且包合物粒徑在90～180 nm之間。在同一構型中，其包埋率和載藥量具有隨碳原子數的增加而逐漸增加的趨勢，對于3 種不同構型的風味物質，OSA-DBS對立體狀風味物質的包埋效果更好。這也為OSA-DBS包埋其他風味物質提供一些參考依據。OSA-DBS-不同構型風味物質包合物的動力學穩定性將是接下來需要深入的研究。