載體油對槲皮素納米乳液理化穩定性和生物利用度的影響

李朝陽，竇中友，張麗萍，刁靜靜，江連洲，馬 萍,*

（1.黑龍江八一農墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

槲皮素是一種廣泛存在于蔬菜（如洋蔥、西蘭花）、水果（如蘋果、藍莓）、谷物和草藥中的黃酮醇類化合物，具有抗菌、抗氧化、抗增殖、抗炎、抗肥胖等生物活性[1]。然而，槲皮素黏膜通透性低，具有高度疏水性和低口服生物利用度（大鼠中小于17%，人類中約1%）[2]。因此，槲皮素食用后直至代謝之前的保護及其在胃腸道的生物活性至關重要。

迄今為止，已有研究報道了不同包封系統，包括脂質體、納米乳液、聚合物納米顆粒等，用以增強親脂性生物活性組分的生物利用度[3]。在這些系統中，納米乳液是一種特別有效的輸送系統，因為它具有制備簡單、安全性高和易于工業化的優點，因此受到越來越多的關注。納米乳液粒徑較小（10～500 nm），具有長期穩定性，可以避免沉淀和聚結現象[4]。近年來，使用模擬胃腸道進行的體外研究表明，槲皮素的生物可及性可以通過改變納米乳液的結構和組成調整[5]。Kwan等[6]研究發現橙油難以與生物活性物質和胃腸道內消化物形成膠束，營養物質的生物可及性較低。因此載體油種類對營養物質利用率有較大的影響。研究發現包含短鏈或中鏈甘油三酯（medium chain triglyceride，MCT）傳遞系統易被消化[7]。另一方面，包含長鏈甘油三酯（long chain triglyceride，LCT）的遞送系統在消化體系中形成混合膠束，生物活性成分易被轉運，但生物利用度較低[8]。前期研究表明，使用MCT配制的基于乳液的輸送系統比使用LCT配制的輸送系統更適合封裝和輸送VE[9]。

本研究旨在制備和表征槲皮素納米乳液。使用體外消化模型結合脂質體特性（MCT與LCT），研究載體油類型和體積分數對高度親脂性類黃酮槲皮素的穩定性和生物可及性的影響。本實驗研究結果將為納米乳液體系的穩定機理研究和實際應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨小豆 國家雜糧技術研究中心；MCT、LCT長沙禎祥生物科技有限公司；NaOH、HCl、石油醚（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；NaCl、CaCl2（均為分析純） 沈陽市華東試劑廠；胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg） 諾維信生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Allegra64R型臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；ZGL-20G型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機 德國Christ公司；Zetasizer Nano-ZS 90型粒度分析儀 英國馬爾文公司；UV755B型紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；PHSJ-4A型實驗室pH計 上海雷磁公司；FA2004B型電子分析天平（精度0.000 1 g） 北京賽多利斯儀器系統有限公司；Turbiscan Lab Expert濃縮體系穩定性分析儀 法國Formulaction公司；S4800型冷凍掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 梨小豆蛋白的提取

參考李楊等[10]提取方法。將梨小豆研磨過80 目篩形成粉狀，加入石油醚脫脂6 h，將脫脂后的梨小豆按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水攪拌混勻，用0.5 mol/L NaOH溶液調節pH值至10.0，在35 ℃水浴鍋中攪拌2 h，3 500 r/min離心20 min取其上清液，用0.5 mol/L HCl溶液調節pH值至5.0，35 ℃靜置2 h，3 500 r/min離心20 min取其沉淀，加水調節pH值至7.0，300 Da透析袋脫鹽，噴霧干燥制得梨小豆蛋白（純度92.6%）。

1.3.2 槲皮素納米乳液的制備

將質量分數2%梨小豆蛋白溶解在去離子水中，用0.5 mol/L NaOH溶液將pH值調節至7.0，55 ℃攪拌2 h，4 ℃過夜使其混合均勻。分散質量分數0.2%槲皮素于2 種選定的載體油（MCT或LCT）中制備油相，然后將其混合成均勻的分散體。將油分散到水相（體積分數5%、10%、15%、20%）中，并使用高速混合器以10 000 r/min乳化3 min，以形成粗糙的乳液，然后使用高壓均質化在100 MPa工作壓力下均質3 次制備納米乳液[10]。

1.3.3 粒度、Zeta電位和聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）

利用Zetasizer Nano-ZS 90型光散射粒度分析儀測定納米乳液的平均粒徑、Zeta電位和PDI。參數設定：油滴的折射率為1.460，水相溶液折射率為1.330，為降低多重光散射效應，分析前用PBS（pH 7.1，0.01 mol/L）稀釋異硫氰酸芐酯納米乳液1 000 倍測粒徑及PDI（用于描述粒徑均一度），稀釋50 倍測Zeta電位[11]。

1.3.4 包封率的測定

槲皮素納米乳液的包封效率參考文獻[12]方法進行測定。將含有槲皮素納米乳液的水性懸浮液10 000 r/min離心10 min，以分離出游離的槲皮素晶體，收集上清液，并與無水乙醇混合。使用紫外-可見分光光度計在波長375 nm處測定該溶液的吸光度。使用已知槲皮素含量的溶液制作標準曲線，計算測定溶液中槲皮素含量。包封率按式（1）計算：

式中：mE為納米乳液中槲皮素的質量/g；mI為槲皮素的初始質量/g。

1.3.5 微觀結構觀察

通過冷凍掃描電鏡對槲皮素納米乳液進行形態觀察[13]。將納米乳液稀釋100 倍，滴加在云母表面，用鋁帶將樣品固定在樣品架上，并使用離子濺射鍍膜機用金鈀濺射。20 kV加速電壓下進行微觀結構分析。使用帶有氣態二次電子檢測器的二次電子圖像獲得微觀結構。為了獲得最佳圖像質量，使用10 mm的標準工作距離和600 kPa壓力。樣品以×300的放大倍率可視化。

1.3.6 納米乳液穩定性

采用李楊等[14]的方法，使用垂直掃描分析儀分析乳液的穩定性。在本實驗中，于平底圓柱形玻璃池上放置5 個樣品（總高度60 mm），并從下到上掃描，以監測樣品在25 ℃下24 h內沿樣品高度色散的光學特性。實驗分為2 次進行，透射比的標準差為小于所有樣品0.2%。平均后向散射在20～50 mm區域內計算，因為此區域不受乳化影響。根據透射比的變化評價各樣品的穩定性。

1.3.7 槲皮素納米乳液體外消化

根據Liu Xiaojuan等[15]的方法，通過模擬口腔、胃和小腸的消化進行體外消化模擬。

1.3.7.1 口腔消化

將納米乳液樣品（20 mL）與等體積的含黏蛋白（5 g/L）的人工唾液工作溶液混合；用0.5 mol/L NaOH將混合物的pH值調節至6.8，然后在37 ℃振蕩器中以100 r/min孵育10 min，測定其粒徑和Zeta電位。

1.3.7.2 胃消化

通過將NaCl（2 g）和HCl（7 mL）溶解在1.0 L的去離子水中制備模擬胃液。將口服消化階段的樣品（20 mL）與含有64 mg胃蛋白酶（1∶1，V/V）的模擬胃液混合，然后使用0.1 mol/L HCl溶液將pH值調節至2.5，并在37 ℃振蕩器中孵育，100 r/min持續120 min。進行胃消化時，測定其粒徑和Zeta電位。

1.3.7.3 小腸消化

制備包含CaCl2、NaCl和脂肪酶溶液（溶解于2.5 mL磷酸鹽緩沖液中的60 mg脂肪酶）的模擬腸液。將消化過程在37 ℃加熱2 h；在持續攪拌下將消化的pH值保持在7.0。使用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液測定樣品的粒徑和Zeta電位。

1.3.8 游離脂肪酸釋放率的測定

根據Silva等[16]的方法，通過滴定法測定槲皮素納米乳液釋放的游離脂肪酸量評估脂解的程度。收集5 mL空腸濾液、回腸濾液和回腸遞送樣品，加入10 mL丙酮以猝滅酶活性，然后加入3 滴1%酚酞溶液作為指示劑。使用0.1 mol/L NaOH溶液進行直接滴定，加入NaOH體積直至滴定終點，并用于計算脂解產生的游離脂肪酸釋放率。因此，釋放的游離脂肪酸由中和游離脂肪酸所需的NaOH物質的量計算，除以甘油三酯可以產生的游離脂肪酸物質的量（假設樣品完全消化，每1 個三酰基甘油分子產生2 個游離脂肪酸），如式（2）所示：

式中：V（NaOH）為中和所產生的游離脂肪酸釋放率所需的NaOH溶液體積/mL；m（NaOH）為所用NaOH的濃度/（mol/L）；wlipid為MCT（LCT）總質量/g；Mlipid為MCT（LCT）摩爾質量/（g/mol）。

1.3.9 槲皮素的生物利用度

根據Altaani等[17]的方法。小腸消化模擬后，使用高速冷凍離心機將10 mL小腸消化后的樣品以5 000 r/min離心40 min，過濾得到上清液。將5 mL上清液與5 mL氯仿混合，渦旋2 min，2 500 r/min離心10 min，將該操作重復2 次。混合底部的氯仿相，并使用紫外分光光度計在波長275 nm處測其吸光度。槲皮素的生物利用度按式（3）計算：

式中：Cfiltration為膠束中槲皮素的吸光度；Crawdigesta為消化液中槲皮素的初始吸光度。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 乳液粒徑、Zeta電位和PDI測定結果

粒徑是用于評估納米乳液性能的主要因素，載體油的種類和體積分數可以在一定程度上決定納米乳液的最終粒徑。如表1所示，相同油脂體積分數下，MCT-納米乳液粒徑小于LCT-納米乳液，隨著油相體積分數升高，MCT-納米乳液粒徑先減小后增加，LCT-納米乳液粒徑顯著增加（P＜0.05）。可以推斷出，油相組成對納米乳液粒徑的影響主要取決于液滴形成的物理化學因素，高壓均質過程中產生液滴尺寸通常會隨著油相黏度和界面張力的降低而減小，MCT的黏度和界面張力低于LCT，因此在均質過程中產生更小的液滴[18-19]。另一方面，LCT具有相對較高的水溶性，這導致形成的納米乳液易形成奧斯特瓦爾德熟化，形成較小液滴后短時間內迅速增長[20]。隨著載體油體積分數增加，液滴相互聚集，乳液粒徑增加。2 種乳液具有較高的負電荷，且隨著體積分數增加，Zeta電位變化不明顯，證明納米乳液Zeta電位與載體油類型和體積分數無關。PDI可以反映粒徑均一度，并且PDI在0～0.3之間表明體系具有均勻的分散。PDI越小，粒度分布越集中[21]。使用不同的油制備的納米乳液的PDI幾乎低于0.3，顯示出均勻的分散性。

表1 載體油類型及體積分數對納米乳液粒徑、Zeta電位和PDI的影響Table 1Effect of carrier oil type and concentration on particle size,zeta-potential and PDI of nanoemulsion

2.2 包封率測定結果

槲皮素在納米乳液中的包封率是評價納米乳液體系質量和應用潛力的重要因素，它反映了槲皮素在制備過程中的保留率和表觀溶解度。圖1結果表明，在使用2 種油相制備的納米乳液中，當槲皮素的負載量固定，油體積分數為5%時，MCT-納米乳液包封率（（84.2±2.14）%）高于LCT-納米乳液（（76.32±3.24）%）。可能是MCT的短酰基鏈與槲皮素之間的氫鍵相互作用，使生物活性物質在MCT中具有高包封率。Aditya等[22]研究發現姜黃素易溶于MCT形成高穩定性、高包封率納米乳液。隨著載體油體積分數增加，槲皮素包封率顯著減小，這主要是因為槲皮素是一種脂溶性營養物質，乳液制備過程中槲皮素均勻分散至油相，相同體積乳化劑不能將其全部包埋，游離槲皮素增加，因此乳液包封率降低。

圖1 載體油種類和體積分數對納米乳液包封率的影響Fig.1 Influence of carrier oil type and concentration on encapsulation efficiency of nanoemulsion

2.3 微觀結構

冷凍掃描電鏡圖能夠以接近原子級的分辨率清晰地顯示出納米分子結構[23]。如圖2所示，冷凍掃描電鏡直接反映了2 種納米乳液的表觀形態和分散狀態，可以看出相同體積分數載體油可以制備形成表觀光滑且粒徑較小的納米顆粒，由于LCT黏度較大，游離油脂吸附在界面層上，形成部分黏連和聚集現象，MCT-納米乳液表現出更小的粒徑，這與2.1節結果一致。

圖2 基于MCT（A）和LCT（B）納米乳液的冷凍掃描電鏡Fig.2 Scanning electron microscopic images of MCT (A) and LCT (B)nanoemulsions

2.4 納米乳液穩定性分析

由于納米乳液體系在熱力學上不穩定，其貯存穩定性易受到粒子碰撞和聚集的影響[24]。在本研究中，前期用于評估膠體分散體穩定性的Turbiscan穩定性分析儀用于研究槲皮素納米乳液的物理穩定性[25]。如圖3所示，2 種樣品左邊曲線未出現向上移動，中間曲線平緩無波動，右邊曲線向上移動現象不明顯。說明樣品在貯藏期間具有較強穩定性，未出現沉淀、脂質析出和聚集等現象。且MCT-納米乳液的曲線相對穩定，這說明在100 MPa的高壓均質下，乳化劑能夠較好地覆蓋在油滴的表面，防止油滴發生聚集。相同體積分數下，不同油相均可以形成穩定的槲皮素納米乳液，且以MCT為載體油，槲皮素納米乳具有更強的穩定性。

圖3 基于MCT（A）和LCT（B）納米乳液的穩定性影響Fig.3 Stability of nanoemulsions based on MCT (A) and LCT (B)

2.5 油脂類型對體外消化影響

如圖4所示，口腔階段，2 種納米乳液的唾液混合物均觀察到絮凝物，并且通過光散射確定2 種乳液的平均粒徑較初始乳液顯著增加（P＜0.05），主要是由于液滴與模擬唾液中的黏蛋白相結合形成聚合物，乳化劑與黏蛋白橋聯形成絮凝。且乳液的Zeta電位也發生明顯變化，這可能是由于口腔模擬液中的陰離子附著到O/W界面上[26]。MCT-納米乳液和LCT-納米乳液的粒徑無顯著差異，說明載體油種類對唾液混合物形態無顯著影響。消化液進入模擬胃階段，2 種納米乳液粒徑顯著增加，這是由于液滴表面的乳化劑被為蛋白酶水解，界面層厚度降低，油相暴露出來形成聚集。另一方面，納米液滴受低pH值和離子的誘導變性，減少了液滴之間的靜電斥力，產生絮凝現象[27]。洪澤翰等[26]研究發現以酪蛋白酸鈉作為乳化劑形成納米乳液在模擬胃液中極易形成聚集。乳液的Zeta電位絕對值降低，由負電荷變成正離子。在小腸階段，2 種納米乳液粒徑顯著減小，這是因為模擬腸液中的脂肪酶將脂肪水解形成陰離子游離脂肪酸，并與槲皮素形成小分子膠束。且由于在消化過程中加入了膽鹽，納米乳液表現為增加的負電荷。這些負電荷可能是未消化的油滴、蛋白質聚集體或膠束等[28]。

圖4 體外消化階段載體油種類對納米乳液粒徑（A）和Zeta電位（B）的影響Fig.4 Effect of carrier oil type on particle size (A) and zeta potential (B) of nanoemulsions during in vitro digestion

2.6 游離脂肪酸釋放率

納米乳液經體外消化模擬，在胰脂肪酶、膽汁鹽和鈣的作用下，三酰基甘油被轉化為游離脂肪酸和單酰基甘油。NaOH可快速與游離脂肪酸發生中和反應，因此，此過程的速率和程度可以通過使用pH值固定方法自動滴定產生的游離脂肪酸監控。如圖5所示，水解過程初始階段，納米乳液的脂肪酸釋放率快速增加，隨著水解時間延長，釋放趨勢逐漸平緩直至達到相對恒定的最終值，與LCT-納米乳液相比，MCT-納米乳液釋放速率更快，可能是因為MCT較LCT溶解性更好[8]。因此在脂肪酶的作用下可以迅速水解，同樣的，LCT黏度較高，游離LCT黏附在O/W界面層上形成保護膜，抑制脂肪酶對液滴的水解能力。

圖5 體外消化過程中不同載體油制備的納米乳液中游離脂肪酸的釋放率Fig.5 Release rate of free fatty acids from nanoemulsion prepared with different carrier oils during in vitro digestion

2.7 槲皮素生物利用度

將口腔、胃和小腸階段的模擬消化后獲得的消化物離心，以獲得含有溶解在該微膠粒中的槲皮素的微膠粒相（中間層）。通過測定膠束相中槲皮素的體積分數和總消化物確定生物利用度。如圖6所示，槲皮素的生物利用度在9%～15%之間，具體取決于用于制備納米乳液的油。在使用LCT制備的納米乳液中，槲皮素的生物利用度明顯較少，主要是由于LCT易與消化液中的陰離子多糖形成聚集體，且LCT黏度較大，吸附在界面層上形成保護膜，從而導致消化率較低[29]。另一方面，LCT-納米乳液具有較大的顆粒尺寸和較低的比表面積，導致其不易被脂肪酶消化水解，生物成分吸收效率下降。相關研究[30-32]發現，富含高不飽和脂肪酸的核桃油不能在消化過程中維持其穩定性，阻礙了營養成分的生物利用度，這與本研究結果一致。

圖6 基于MCT和LCT的納米乳液中槲皮素生物利用度Fig.6 Bioavailability of quercetin in nanoemulsions based on MCT and LCT

3 結 論

以MCT和LCT為載體油，利用高壓均質制備槲皮素納米乳液，并評估其穩定性和生物利用度。結果表明，由MCT制得的納米乳液具有更小的粒徑和穩定性，這種現象歸因于載體油相對低的水溶性，使奧斯特瓦爾德熟化率降低。油相體積分數越高，粒徑越大，但油相種類對其Zeta電位無顯著影響。在體外消化過程中，2 種納米乳液粒徑均先增加后降低，MCT-納米乳液脂肪釋放率最終值較LCT-納米乳液高，與槲皮素生物利用度呈正相關。因此，以MCT作為載體油可以得到高穩定性納米乳液體系，顯著增加生物活性成分的消化吸收。