豆粕血管緊張素轉化酶抑制肽的結構鑒定及作用機制解析

劉靜波，王子秦，于一丁，張 婷，劉博群*

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林省營養與功能重點實驗室，吉林 長春 130062）

本研究以豆粕為原料，通過超聲輔助酶解制備ACE抑制活性肽，并進行分離純化、結構鑒定，采用分子對接技術闡述ACE抑制活性肽的作用機理，旨在為豆粕原料深加工和高效利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粕 中國長春市華程生物技術有限公司；復合風味蛋白酶（酶活力500 LAPU/g） 諾維信公司；馬尿酸馬尿酰-組胺酰-亮氨酸、A6778 ACE（來自兔肺，3.7 U/mg蛋白質（Warbur-Christian改性），批號SLBZ2889） 美國Sigma公司；氫氧化鈉 北京化工廠；乙腈、甲酸、三氟乙酸（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；合成肽 生工生物工程（上海）股份有限公司；P0017考馬斯亮藍快速染色液 上海碧云天生物技術公司；PR1300超低分子質量蛋白質Marker（3.3～20.1 kDa）、P1320 Tris-Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JY92-2D超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；XX8200230小型切向流超濾系統美國密理博公司；蛋白純化系統 瑞典?KTA公司；FD-1A-50冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；Orbitrap Elite高場靜電場軌道離子阱質譜儀 美國Thermo Fisher公司；LC-2010超高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；Z800計算工作站 美國惠普公司；FD-1A-50冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；Chemi Doc凝膠成像儀 美國伯樂公司；TY-80B脫色搖床常州市國立實驗設備研究所。

1.3 方法

1.3.1 豆粕肽的制備

將豆粕粉碎后過60 目篩，按底物質量濃度4 g/100 mL制備豆粕水溶液，并調至復合風味蛋白酶的最適pH值為6.5，磁力攪拌15 min。隨后進行超聲波預處理（150 W，12 min），再置于酶的最適溫度50 ℃恒溫水浴鍋中，酶與底物質量之比為1∶100，酶解7 h后，進行滅酶操作（90 ℃，10 min），將酶解液冷卻至室溫后，進行離心處理（4 ℃、4 000 r/min離心10 min），收集上清液進行下一步分離純化。

1.3.2 豆粕肽的分離純化及分子質量分布鑒定

所以，不能簡單地認為模式創新降低了某方面成本，就意味著整體成本的降低。在今天看來，成本這本賬不是一個簡單的加減法。

將酶解上清液用Tris-Tricine-SDS-PAGE方法對其分子質量分布進行鑒定，隨后用截留分子質量為0.2、1、3、10 kDa和30 kDa的超濾膜進行分離，收集5 種豆粕肽組分（0.2～1、1～3、3～10、10～30、＞30 kDa），對比各自體外ACE抑制活性值，并選取最優的活性組分（0.2～1 kDa）經過?KTA蛋白質純化系統（層析介質SephadexG15、上樣量4 mL、洗脫流速1.0 mL/min）進一步分離純化，將分離得到的5 個不同峰（F1、F2、F3、F4、F5）組分進行收集，經真空冷凍干燥后，－20 ℃貯存，以備進行體外ACE抑制活性指標測定。

1.3.3 豆粕肽體外ACE抑制活性的測定

采用實驗室已建立的高效液相色譜法[24]。

1.3.4 ACE抑制肽序列鑒定

利用液相色譜-串聯質譜對ACE抑制活性最高的純化組分F2峰進行鑒定。通過Orbitrap Elite質譜儀的EASY-nLC 1000系統分析樣品，色譜條件：色譜柱填料為C18，預柱（長度2 cm、內徑100 μm），分析柱（長度15 cm、內徑75 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸溶液（V/V），B相為0.1%甲酸-乙腈溶液（V/V）；梯度洗脫：0～2 min，98%A，2% B；2～77 min，98%～65% A，2%～35% B；77～81 min，65%～25% A，35%～75% B；81～91 min，25% A，75% B；進樣量2 μL；流速300 nL/min。

質譜條件：離子化方式：電子電離源；電壓：2 200 V；質量掃描范圍m/z350～1 600，選取一級譜后3 s內信號最好的峰做二級碎裂，碎裂模式為高能誘導裂解技術（higher energy collision induced dissociation，HCD）。在數據依賴模式下運行，在傅里葉變換模式下進行全質譜掃描，分辨率為60 000。自動增益控制目標為4×105一級離子軌道掃描和5×104二級質譜掃描。動態排除采用以下參數：隔離窗口m/z2；重復計數1；重復持續時間25 s；排除時間為60 s。所得結果經過與蛋白質數據庫（UniProt）比對，得到氨基酸序列。

1.3.5 ACE抑制活性肽的合成

采用9-芴基甲氧基羰基保護基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）固相合成方法合成寡肽（純度98%），由上海生工生物工程股份有限公司協助完成。

1.3.6 分子對接[25]及ACE抑制肽活性機制解析

先利用AutoDock Tools 1.5.4軟件對活性肽配體和ACE受體進行對接前的準備，再通過軟件AutoDock 4.2進行活性肽與ACE晶體結構展開半柔性分子對接計算[26]，最后對分子對接的結果進行可視化處理，具體操作如下：

從RCSB蛋白質數據庫（http://www.rcsb.org/）獲得ACE晶體結構（PDB ID：1O86）。大分子受體的準備：去除1O86周圍的水分子以及小分子配體（GLY2000、LPR702），保留Zn2+、Cl－和ACE蛋白，再加力場，獲得pdb格式文件；加極性氫并添加原子類型后保存為pdbqt格式文件。小分子肽配體的準備：運用CHARMM力場對小分子肽進行能量最小化處理獲得pdb格式文件；判定肽的root后選擇配體的可旋轉鍵，保存為pdbqt格式文件并手動更改可旋轉鍵數。格點（Grid）文件的準備：為了提高ACE與活性肽對接的準確度，采用Zn2+的空間坐標為中心（中心坐標為x=43.821，y=38.240，z=46.712）建立一個間距為0.375 ?，大小為100 ?×100 ?×100 ?的反應約束盒子[27]。將準備好的受體“1O86”的pdbqt格式文件和配體“肽”的pdbqt格式文件進行分子對接：運用拉馬克遺傳算法對分子對接能量進行優化并進行200 次對接模擬，最終保存為“1O86-肽”dpf格式文件。分別通過Discovery Studio可視化版本、PyMOL蛋白可視化軟件對ACE抑制肽與ACE蛋白分子間相互作用（靜電力、氫鍵、親水/疏水作用力等）進行分析和展示[28]，同時確定肽周圍3.5 ?的ACE上的氨基酸殘基，從而對ACE抑制肽活性機制進行解析。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 豆粕肽分子質量和分離純化后不同組分體外ACE抑制活性分析

首先對制備出豆粕肽的分子質量進行鑒定，Tris-Tricine-SDS-PAGE結果如圖1A所示，豆粕肽的分子質量主要集中在6 000 Da以下分布。對其超濾分離后，得到了5 組不同分子質量的豆粕肽進行ACE抑制活性測定，低分子質量（200～1 000 Da）的抑制活性較高，達到了217.33 μg/mL（圖1B）。這一現象與Pihlanto等[29]研究結果相符合，一方面可能是因為分子質量在1 000 Da以下的超濾組分可能包含了酶解液中多數的ACE抑制活性肽，另一方面可能是因為ACE與肽結合位點是在ACE的活性中心，且存在疏水孔道，分子質量太大的肽無法進入此通道，導致分子質量較小的肽可能具有更高的ACE抑制活性。對低分子質量（200～1 000 Da）的豆粕肽進一步經過色譜純化，得到了峰圖（圖1C）并經體外ACE抑制活性實驗得到F2峰的ACE抑制活性較高，其IC50可低至（97±0.5）μg/mL（圖1D）。故本研究將低分子質量（200～1 000 Da）肽中的F2組分進行肽序列鑒定。

圖1 豆粕肽分子質量及ACE抑制活性分析Fig.1 The analysis for molecular mass of peptides from soybean meal and ACE-inhibiting activity

2.2 ACE抑制肽序列鑒定結果

將200～1 000 Da的豆粕肽酶解液組分經?KTA繼續純化得到的F2組分凍干樣品通過液相色譜-串聯質譜進行鑒定，所得二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，鑒定并選取三肽22 條（GCP、GDP、GGP、GGW、GHP、GMP、GRP、GTY、GVW、GYW、IEW、ILP、IQP、LEP、LLY、VHP、VPP、VPW、VRP、VSP、VTP、VWW）；四肽序列25 條（GCPP、GGCP、GGGW、GHDP、GKSP、GLVP、GNLP、GPVY、GTYW、GVRP、GWCP、IVTP、LALP、LASP、LCGY、LGRP、LKIW、LDDY、LILP、LNKY、LVPP、VPWP、VQVP、VVTP、VYVW）；五肽序列34 條（GDDFW、GEQMP、GGCPP、GGPVY、GGVRP、GGWCP、GHDPY、GLDDY、GLVPP、GSCLY、GWCTW、IDDGW、IIVTP、IQFAP、IQPDW、ISGGP、LAKAY、LCGYW、LEENY、LFEDP、LKVHP、LSEEY、LTEVP、LTVSP、VEQVY、VFAVY、VGHDP、VGLVP、VHCAY、VKFDY、VPGMP、VQVPW、VSLEP、VTPSP），再以最低預測自由能為評價指標，通過AutoDock進行虛擬篩選，共得到2 個最低預測結合能較優的多肽序列，四肽GVRP和五肽IIVTP的最低預測自由能分別為－8.44 kcal/mol和－9.04 kcal/mol。一般來說，對接最低預測結合能值越低，表示ACE-肽結合越緊密，ACE-肽復合物越穩定。

圖2C表明GVRP通過HCD碰撞斷裂所產生的bn與yn離子系列，其中b2離子157.12、b3離子313.23分別與m/z157.10、313.20相匹配，y1離子116.10、y2離子272.14、y3離子371.19以及y4離子427.23分別與m/z116.07、272.17、371.24以及427.25相匹配，其中有誤差的均為部分減水、減氫導致，并已經標注。

圖2 GVRP（A）、IIVTP（B）的結構式及GVRP（C）、IIVTP（D）的二級質譜圖Fig.2 Structural formulae of GVRP (A) and IIVTP (B), and secondary MS of GVRP (C) and IIVTP (D)

同理，對IIVTP（Ile-Ile-Val-Thr-Pro）進行同樣的數據分析和討論，其結構式如圖2B所示，二級質譜圖（圖2D）結果表明IIVTP通過HCD碰撞斷裂所產生的bn與yn離子系列，其中b2離子227.15、b3離子326.20和b3離子427.29分別與m/z227.18、326.24、427.29相匹配，y1離子116.10、y2離子217.12、y3離子316.18、y4離子429.15以及y5離子541.34分別與m/z116.07、217.12、316.19、429.27及541.35相匹配，其中有誤差的均為部分減水、減氫、減氨基的原因所致，并已經標注。

2.3 ACE抑制肽的合成與活性測定

對四肽GVRP和五肽IIVTP采用FMOC固相合成方法合成，并利用高效液相色譜法測定其體外ACE抑制活性，IC50值分別為（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L，IC50值越小活性越大。經過對GVRP、IIVTP的IC50與酶解液的IC50統一單位（μg/mL）進行比較，計算可得其IC50分別為：GVRP（35.91 μg/mL）、IIVTP（41.71 μg/mL），由此可得合成的純肽GVRP、IIVTP的ACE抑制活性明顯好于200～1 000 Da中F2峰酶解液的ACE抑制活性（（97±0.5）μg/mL）。GVRP的分子質量是427.5 Da，等電點為pH 11.05；IIVTP的分子質量是541.69 Da，等電點為pH 5.52。這與Iwaniak等[30]的研究結果一致：體外ACE抑制活性的肽序列常常表現出以下2 種特征：N端為疏水性氨基酸，尤其是包含有脂鏈的氨基酸Gly、Ile、Leu、Val；C端包含有芳香環的氨基酸Pro、Tyr、Trp。

2.4 分子對接與豆粕ACE抑制肽的抑制機理解析

研究表明，ACE抑制肽的氨基酸構成與它的抑制活性有著緊密的關系，所以，四肽和五肽的氨基酸殘基和ACE相互作用關系的探討有助于對ACE抑制活性機理進一步解析[31-32]。通過AutoDock程序研究了GVRP、IIVTP對ACE的抑制機制，從分子角度闡述優選出的ACE抑制活性肽與ACE結合的具體關系。

配體與ACE殘基的過近接觸示意圖如圖3所示。過近接觸是指至少有一個原子存在于配體周圍3.5 ?范圍內。由表1可知，四肽GVRP與ACE的氨基酸殘基Glu403（OE2：2.0 ?；OE1：2.0 ?）、Glu384（OE2：2.0 ?）、Tyr523（OH：2.1 ?）之間形成了4 個氫鍵，其中GVRP和氨基酸殘基Glu403之間含有2 個氫鍵鹽橋；與Glu384之間含有1 個氫鍵鹽橋；與Tyr523之間形成的傳統氫鍵且氫鍵的鍵長最長，結合最不緊密。五肽IIVTP與ACE的氨基酸殘基Lys511（HZ3：2.8 ?）、Gln281（HE22：1.7 ?）、His353（HE2：2.0 ?；HE1：2.1 ?）、His513（HE2：3.0 ?；HE1：1.7 ?）、Glu162（OE2：1.8 ?）、Asp377（OD1：2.6 ?）之間形成了8 個氫鍵，其中GVRP和氨基酸殘基Lys511之間含有1 個氫鍵鹽橋；與Gln281、Glu162之間各含有1 個傳統氫鍵；與His353、His513之間分別形成1 個傳統氫鍵和1 個碳氫鍵；與Asp377之間形成1 個碳氫鍵。其中與Gln281的傳統氫鍵鍵長和與His513的碳氫鍵鍵長較其他氫鍵相比最短，結合最為緊密。

圖3 GRVP（A）與IIVTP（B）結合ACE活性中心Fig.3 Active binding sites of ACE for GVRP (A) and IIVTP (B)

表1 GVRP與ACE間氫鍵作用、IIVTP與ACE間氫鍵作用Table 1Hydrogen bonding between GVRP and ACE, and between IIVTP and ACE

與此同時，找到GVRP、IIVTP配體周圍過近接觸在3.5 ?范圍內的ACE氨基酸殘基（表2），因為這些殘基對配體和受體的結合起到至關重要的作用，比如疏水作用力和靜電力，通過比對發現GVRP和IIVTP配體周圍共有的過近接觸ACE氨基酸殘基為His513、Ala354和Glu384，極大程度上豐富了ACE可能活性位置的研究。

表2 GVRP與ACE間存在過近接觸的ACE殘基、IIVTP與ACE間存在過近接觸的ACE殘基Table 2Residues of ACE closely contacting with GVRP and those closely contacting with IIVTP

樊玥[33]通過分子對接結果得出ACE含有活性口袋S1、S1’、S2，口袋S1中包含氨基酸殘基Ala354、Glu384、Tyr523，口袋S1’包含氨基酸殘基Glu162，口袋S2包含氨基酸殘基Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520。管驍等[34]指出常見的ACE活性口袋包含以下氨基酸殘基：His353、Ala354、Ser355、Ala356、Val380、His383、Glu384、His387、Glu411、Lys511、Phe512、His513、Val518、Tyr520、Arg522、Tyr523。經過比對發現GVRP可以與ACE的S1活性口袋中的2 個氨基酸殘基Glu384、Tyr523進行結合；IIVTP可以分別與ACE的S1’活性口袋氨基酸殘基Glu162，以及ACE的S2活性口袋氨基酸殘基Lys511、Gln281、His513、His353進行結合。

對比GVRP和IIVTP與ACE結合產生的氫鍵個數可以發現，GVRP的氫鍵個數為4 個，IIVTP的氫鍵個數為8 個，研究表明短肽與ACE形成越多的氫鍵，具有越強的相互作用[35]，與ACE抑制活性GVRP的IC50值（84±0.06）μmol/L，IIVTP的IC50值（77±0.08）μmol/L相吻合，即IIVTP的活性優于GVRP的活性。由此可知，肽和越多的ACE活性口袋結合時，其抑制活性顯著增強；且短肽與ACE形成越多越強的氫鍵，就能夠顯著增強ACE和短肽的分子間相互作用，同時可以提高肽的ACE抑制活性。

3 結 論

目前，豆粕肽的研究主要集中在優化制備階段，進一步分離提純、鑒定活性肽氨基酸序列，獲得具有較高生物活性的多功能小肽，是今后研究的主要方向。本實驗采用質譜和分子對接技術，最終篩選出ACE抑制活性較強的四肽Gly-Arg-Val-Pro（GVRP）和五肽Ile-Ile-Val-Thr-Pro（IIVTP）。通過體外ACE抑制活性測定其IC50值為（84±0.06）μmol/L和（77±0.08）μmol/L；最低預測結合能分別為－8.44 kcal/mol和－9.04 kcal/mol。通過分子對接技術發現GVRP、IIVTP與ACE的活性口袋S1、S1′、S2中的殘基具有較強的結合力，且IIVTP可同時與S1′和S2活性口袋中多個氨基酸殘基結合，這也可能是IIVTP活性強于GVRP的原因。本方法的建立為后續深度開發豆粕肽的高價值利用提供了參考與借鑒。