產4-乙基愈創木酚酵母的鑒定及其在醬油中的應用

鄒謀勇，何理琴，孫啟星，朱新貴

（1.李錦記（新會）食品有限公司，廣東 江門 529100；2.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

醬油是以大豆、面粉等為主要原料，經微生物發酵而成的一種典型的傳統調味食品，它具有香氣濃郁、滋味豐富的特點，在人們日常生活中不可或缺。隨著生活水平的提高，人們對調味品的口感、香氣等方面提出了更高的要求[1]。在醬油風味研究方面，主要有風味成分構成[2-4]和風味物質形成機理[5-7]兩個重要研究方向。目前已鑒定得到超過300 種醬油的揮發性香氣成分[8-9]，這些揮發性香氣成分相互作用，成為醬油重要特征香氣成分的來源。

高沸點特征香氣成分是醬油在烹飪過程持續留香的物質基礎。目前從醬油中發現的高沸點香氣成分有：吡嗪類化合物、呋喃酮、4-乙基愈創木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）、4-乙烯基愈創木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）、苯乙醇等。在這些高沸點特征香氣成分中，4-EG呈煙熏及辛香味[9-10]，屬醬香型香料，其作為醬油關鍵風味成分，具有緩和咸味作用，這在世界釀造行業得到公認[11-12]。Yokotsuka等[13]首次在醬油中發現4-EG，將其作為醬油風味成分的指標。而假絲酵母在醬油發酵后期會產生4-EG等酚類成分，賦予醬油獨特風味[14]。Yasuhiko等[15]研究表明，在醬油和味噌中分離出7 株耐鹽酵母，能代謝合成4-EG或4-VG；微生物轉化合成4-EG途徑主要是以阿魏酸為前體，通過阿魏酸脫羧酶和4-VG還原酶合成4-EG。在已發現的微生物中，部分畢赤酵母屬、漢遜德巴利酵母、枯草芽孢桿菌、木糖葡萄球菌、假絲酵母等只是將阿魏酸轉化為4-VG；假絲酵母、酒香酵母等可將4-VG還原為4-EG，只有少部分假絲酵母菌株可利用阿魏酸直接合成4-EG[15-17]。

近年來，利用不同菌株混合培養或通過在發酵過程中添加菌株純培養物強化食品發酵已成為改造傳統食品發酵業研究熱點[18]。楊希飛[19]在醬油發酵過程中添加嗜鹽四聯球菌，結果顯著提高了醬油中酯類物質的種類和含量，改善了醬油的風味品質。Wah等[20]將季也蒙畢赤酵母和魯氏酵母接種到醬油釀造初期，能促進醬油揮發性風味物質的形成。Akolkar等[21]通過將Halobacteriumsp.菌懸液接種到魚露發酵醪中，能明顯改善魚露風味，同時提高其營養價值。張良等[22]通過微生物強化接種，將酵母菌劑和嗜鹽四聯球菌菌劑添加到發酵后期的郫縣豆瓣醬中進行聯合發酵，提高了后發酵階段郫縣豆瓣醬4-EG的含量，改善了郫縣豆瓣風味品質。上述研究表明，生物強化技術是提升釀造調味品風味品質的重要技術手段之一。因此，分離篩選能直接將阿魏酸代謝合成4-EG的微生物，并通過生物強化技術應用于醬油工業化生產，以提高醬油中4-EG的含量，這對于醬油類產品品質提升有重要意義。然而在4-EG菌株篩選鑒定，及其合成代謝調控方面研究文獻較少，在實際生產中的應用更是鮮有報道。

基于此，本研究從醬油發酵醪中分離篩選得到1 株產4-EG的酵母A10-2，采用生理生化測試和分子生物學方法對其鑒定，然后探究其在不同鹽度培養基中的生長情況。通過底物添加實驗，研究4-EG代謝合成途徑。采用A10-2開發高4-EG含量的半成品，并應用于醬油調配，分析其對產品風味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油發酵醪 李錦記（新會）食品有限公司。

麥芽汁培養基：13%麥芽汁培養基；酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：1%酵母浸粉，2%葡萄糖，2%胰蛋白胨，15% NaCl；醬醪發酵液培養基：取發酵2 周醬油發酵醪，10 層紗布過濾，上清液為醬醪發酵培養基；發酵培養基：10%巴氏殺菌醬油，0.5%酵母浸粉，2%葡萄糖，0.5%胰蛋白胨，15% NaCl。

麥芽汁培養基、技術瓊脂 廣東環凱微生物科技有限公司；生理生化實驗試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；麥芽浸粉、胰蛋白胨 北京路橋技術股份有限公司；阿魏酸、4-EG（99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他生化試劑均為分析純 廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Blue Star紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；7820A-5977B氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀美國安捷倫科技有限公司；固相微萃取手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國色譜科公司。

1.3 方法

1.3.1 產香酵母分離

取不同發酵階段的醬油發酵醪，用0.85%生理鹽水稀釋一定梯度后涂布含有麥芽汁培養基的平板上，30 ℃靜置培養96 h，挑取單菌落進行進一步劃線分離純化。挑取純化后的菌株接種于YPD培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養41 h，得到種子液，將種子培養液按1%分別接種到醬油發酵液培養基；然后30 ℃、100 r/min振蕩培養13 d，進行香氣鑒評，將呈醬香發酵液對應的菌株命名為A10-2。

1.3.2 產香酵母A10-2揮發性風味成分分析

對A10-2發酵液頂空固相微萃取并進行GC-MS分析。取2 mL樣品于4 mL樣品瓶中，將萃取頭插入到樣品瓶的頂空部分，40 ℃保溫萃取時間30 min。萃取結束后，立即進樣，解吸時間為2 min。色譜條件：色譜柱為DB-WA×U2毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升溫至150 ℃，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，保留10 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為He（99.999%）。質譜條件：電離能70 eV，檢測電壓1 510 V；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；掃描速率2.00 scans/s，質量掃描范圍m/z20～350。GC-MS得到揮發性風味物質總離子流圖，手動積分計算與數據庫標準物質相似度80%以上風味物質的峰面積，風味物質峰面積與總峰面積的比值為該物質的相對含量。

4-EG定量分析：取5 mL培養液，加入30 mL乙醚，萃取3 次；收集上層萃取液真空濃縮，并溶于無水乙醇，根據濃度合理稀釋并用GC-MS進行定量分析。具體如下：氣相色譜載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，進樣量1.0 μL，分流比10∶1；升溫程序：40 ℃保留1 min；以10 ℃/min升溫到210 ℃，保留0 min；再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保留3 min。質譜條件：采用電子電離方式，電離能70 eV，檢測器電壓1 597 V，掃描范圍m/z30～200，掃描速率2.00 scans/s；進樣口和離子源溫度分別為250 ℃和230 ℃。采用單離子掃描模式，以m/z91、122、137和152.0四個離子為定量離子進行分析。4-EG標準曲線制作：取色譜純4-EG梯度稀釋到質量濃度10、20、70、100 mg/L，采用上述色譜和質譜條件檢測不同質量濃度4-EG的定量離子峰面積，線性回歸得到標準曲線方程為：y=1.171×105x+1.125×105（R2=0.995 4），其中y為響應值，x為4-EG含量。以標準曲線計算樣品中4-EG含量。

1.3.3 生理生化實驗

參照文獻[23]對A10-2進行生理生化實驗。

1.3.4 A10-2菌株分子鑒定

自菌株A10-2基因組聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增rDNA-ITS序列。30 μL PCR體系：20 ng DNA模板（菌株A10-2基因組），25 pmol通用引物（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），100 μmol/L dNTP，1 mmol/L MgCl2和2.5 U HiFi DNA聚合酶，PCR產物由華大基因測序。通過BLAST（http∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫進行ITS rDNA同源序列檢索與分析。

1.3.5W.versatilisA10-2耐鹽實驗

挑取A10-2單菌落接種于YPD培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養41 h ，得到A10-2種子液。取200 mL種子培養液4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀采用0.85%生理鹽水洗滌2 遍，再用0.85%生理鹽水重懸，并定容到200 mL。將種子液按照5%接種量分別接種含0%、5%、10%、14%、18% NaCl的麥芽汁培養基，按照一定的時間間隔取培養液在600 nm波長處測定OD值。

1.3.6W.versatilisA10-2菌株在不同底物培養基中代謝產生的揮發性風味物質分析

挑取A10-2單菌落接種于YPD培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養41 h，得到種子液，將種子培養液按1%分別接種到以下發酵培養基：第1組發酵培養基添加50 mg/L阿魏酸，第2組發酵培養基添加30 mg/L 4-VG。然后30 ℃、100 r/min振蕩培養11 d，將呈醬香發酵液進行GC-MS分析。

1.3.7W.versatilisA10-2在醬油發酵中的應用

A10-2種子液制備方法同1.3.5節，將種子液按照2%接種到巴氏殺菌醬油發酵液，對照組加入2% YPD培養基。30 ℃、100 r/min振蕩培養一定的時間，取發酵液進行理化指標測定，同時檢測發酵液中4-EG質量濃度。

1.3.8 感官評價

取巴氏殺菌醬油發酵液，添加50 mg/L阿魏酸，接種A10-2發酵12 d，取發酵液過濾，并進行巴氏殺菌（70 ℃，30 min）；巴氏殺菌后的發酵液冷卻后按照10%添加到成品醬油中，從李錦記（新會）食品有限公司技術部、質檢部和品控部隨機選取8 位受到系統培訓的的品評員進行盲評。口感方面分別從咸味、鮮味、苦味、甜味、酸味、厚味、綜合口感、偏愛程度8 個維度對樣品進行評分；香氣方面分別從酸味、豆香、麥芽香、焦香、醇香、綜合香氣、醬香、偏愛程度8 個維度對樣品進行評分。評分方法為：每個維度滿分為10 分，感官強度大則得分高；每位品評員對每組樣品盲評3 次，時間間隔30 min，計算平均分，各維度得分為8 位品評員的評分算術平均數。

1.4 數據分析

GC-MS總離子流圖為GC-MS數據處理軟件導出；耐鹽性分析結果采用OriginPro 8.5進行繪圖，感官評價結果采用Microsoft Office Excel繪制雷達圖。

2 結果與分析

2.1 產香酵母A10-2揮發性風味成分的鑒定

采用頂空固相微萃取-GC-MS對添加A10-2種子液連續發酵13 d的醬油發酵液進行揮發性物質分析，結果如圖1所示。實驗組揮發性成分中含有多種醇類物質，包括乙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、β-乙基苯乙醇等，其中苯乙醇含量較高；對照組檢出了乙醇和異戊醇，實驗組檢出峰面積相對較大，說明A10-2具有進一步合成乙醇、異戊醇的能力（表1）。同時，實驗組在51.863 min檢出了4-EG，說明A10-2具有利用醬油本底前體物質合成4-EG的能力。研究發現Candida guilliermondii和C.fermentati可以利用阿魏酸合成4-VG，并進一步還原為4-EG；該過程涉及的兩個關鍵酶分別為阿魏酸脫羧酶和4-VG還原酶[15]。

表1 產香酵母A10-2揮發性風味成分相對定量分析Table 1Relative quantitative analysis of volatile flavor compounds from A10-2

圖1 GC-MS對產香酵母A10-2揮發性風味成分分析Fig.1 Analysis of flavor components from A10-2 by GC-MS

2.2 產香酵母A10-2形態特征

如圖2a所示，產香酵母A10-2在麥芽汁平板上菌落淡黃色，奶油狀，菌落邊緣整齊暗淡無光澤。顯微鏡觀察發現，A10-2均為球狀或橢球狀，菌體直徑為1～5 μm，可見出芽生殖（圖2b）。根據A10-2菌落形態和菌體顯微鏡觀察初步推測其為酵母類微生物。

圖2 產香酵母A10-2菌落形態（a）與菌體形態（b）Fig.2 Colonial morphology (a) and thallus morphology (b) of A10-2

2.3 產香酵母A10-2生理生化鑒定

如表2所示，A10-2發酵葡萄糖能力較強，發酵半乳糖能力較弱，不能發酵木糖、阿拉伯糖、麥芽糖等糖類物質；除海藻糖、乳糖、赤蘚糖外，能同化已測試的全部糖類，不能利用淀粉，可以同化甘露醇、乙醇和甘油。此外，A10-2可以同化硝酸鈉，在37 ℃溫度下能較好生長，在高鹽（18% NaCl）環境中也能增殖，在無維生素培養中能緩慢生長，而脲酶、50%葡萄糖、1%乙酸測試均為陰性。采用文獻[23]方法進行生理生化特征比對，初步鑒定A10-2為Wickerhamiella屬微生物。

表2 產香酵母A10-2生理生化測試結果Table 2Physiological and biochemical identification of A10-2

2.4 產香酵母A10-2分子生物學鑒定

為進一步鑒定A10-2的分類學地位，對其ITS rDNA序列進行克隆，PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3，顯示其片段長度約450 bp。DNA測序結果表明PCR擴增到的ITS rDNA序列長度為434 bp。該序列提交GenBank并進行BLAST分析，結果顯示A10-2與Wickerhamiella versatilis相似性為100%。綜合形態學觀察、生理生化測試和分子生物學鑒定，初步確定A10-2為W.versatilis。Clara等[24]通過分類學研究將Brettanomyces versatilis轉為W.versatilis，Brettanomyces屬微生物是葡萄酒發酵中重要的微生物，具有代謝酚類物質的能力，對葡萄酒風味的形成有重要貢獻[25]。因此推測W.versatilis在醬油酚類化合物代謝中發揮重要作用。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測A10-2 ITS rDNA序列PCR產物Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of ITS rDNA sequence from A10-2

2.5 W.versatilis A10-2耐鹽性分析

如圖4所示，NaCl質量分數對A10-2生長曲線影響顯著，當NaCl質量分數為5%時，最適宜A10-2生長，NaCl質量分數為18%時，生長延遲期明顯延長，延遲期達到30 h。說明A10-2具有一定的耐鹽性，可以在高鹽（18% NaCl）環境中生長，但細胞增殖速率受到一定程度的抑制。

圖4 A10-2在不同質量分數NaCl麥芽汁培養基中生長曲線分析Fig.4 Growth curves of W.versatilis A10-2 in media with various NaCl concentrations

2.6 W.versatilis A10-2菌株4-EG合成代謝途徑分析

已有文獻表明，酵母類微生物可以利用阿魏酸作為前體物質代謝合成4-EG，主要中間代謝產物為4-VG[15]。因此，本研究將阿魏酸、4-VG作為底物分別添加發酵培養基，接種W.versatilisA10-2進行發酵，以分析菌株的4-EG合成代謝途徑，結果如圖5所示。添加阿魏酸或者4-VG后，發酵液中均檢出了大量的4-EG；其中阿魏酸組同時檢出了4-VG（圖5a），4-VG組檢出的4-VG相對峰面積較對照組下降了89.4%（圖5b，表3）。表明W.versatilisA10-2主要以阿魏酸為底物，在阿魏酸脫羧酶的作用下脫去羧基得到中間產物4-VG，進一步通過4-VG還原酶催化得到4-EG。已有研究表明C.versatilis具有將阿魏酸代謝成為4-VG和4-EG的能力，其代謝能力受到發酵條件的影響；在醬油中C.versatilis代謝阿魏酸合成4-VG和4-EG的得率約為20%[26]。在細菌研究中發現Bacillus pumilusS-1具有快速將阿魏酸代謝成為4-VG的能力[27]。但是關于Wickerhamiella代謝酚類化合物的研究鮮有報道。

圖5 W.versatilisA10-2菌株代謝4-EG合成前體物質的能力分析Fig.5 Analysis of the ability of W.versatilis A10-2 to metabolize precursor substances of 4-EG

表3 W.versatilis A10-2代謝合成4-EG和4-VG相對含量Table 3Relative quantitative analysis of 4-EG and 4-VG from W.versatilis A10-2

2.7 W.versatilis A10-2在醬油中的應用

添加W.versatilisA10-2種子培養液到醬油發酵液中，其理化指標測定結果如表4所示，實驗組氨基酸態氮與對照組（未接種A10-2）相近，總酸較對照組有一定幅度提升，而還原糖、pH值有一定幅度降低，推測主要原因是還原糖被W.versatilisA10-2代謝利用，并產生了一定量的酸性物質。上述結果表明，W.versatilisA10-2應用于醬油發酵液，對氨基酸態氮影響不顯著，可輕微提高總酸含量，并降低還原糖含量。

表4 W.versatilis A10-2添加對醬油發酵液理化指標的影響Table 4Effect of W.versatilis A10-2 on physicochemical indexes of soy sauce mash

為了驗證W.versatilisA10-2在醬油發酵液中4-EG的代謝能力，采用GC-MS對上述發酵液進行了4-EG定量分析，結果如表5所示。發酵12 d，4-EG質量濃度為0.63 mg/mL，添加阿魏酸后4-EG含量質量濃度進一步提高為12.05 mg/mL（表5），對照組（未接種A10-2）未檢出4-EG。這一結果證實W.versatilisA10-2可在醬油發酵液中合成4-EG，添加阿魏酸可以顯著提高4-EG含量，因此認為其具有優化提高醬油發酵液4-EG含量的應用潛力。研究發現微生物代謝是醬油風味物質的形成重要因素，建立醬油微生物組學、代謝組學和風味物質譜的聯系是未來醬油風味研究的重要方向[28]。在醬油耐鹽酵母的應用中，Sluis等[29]發現固定化Zygosaccharomyces rouxii、C.versatilis細胞對于加快醬油風味物質的積累有重要意義。同時，Tetragenococcus halophilus和C.versatilis共同培養與醬油風味物質的形成高度相關，并發現T.halophilus對醬油鮮味物質的形成有重要貢獻[30]。因此，耐鹽酵母在醬油發酵中的應用對于提升醬油風味品質有非常重要的意義[31]。如圖6所示，香氣鑒評表明，將添加W.versatilisA10-2得到的高4-EG含量醬油發酵液調配到成品醬油中，香氣方面，可以一定程度上提升成品醬油醬香、醇香和焦香；口感方面，可一定程度緩和咸味，同時能夠提升鑒評人員的偏好程度。說明其在醬油風味和口感改善的方面有較大的應用前景，對于迎合消費者需求具有重要意義。

表5 W.versatilis A10-2添加對醬油發酵液中4-EG含量的影響Table 5Effect of W.versatilis A10-2 on content of 4-EG in soy sauce mash

圖6 W.versatilis A10-2高4-EG含量醬油發酵液對醬油香氣（a）和滋味（b）的影響Fig.6 Effect of high 4-EG concentration in fermentation broth of W.versatilis A10-2 on aroma (a) and taste (b) of soy sauce

3 結 論

EG是醬油中關鍵風味物質，也是典型醬香味的特征風味物質之一，一定濃度的4-EG對醬油的風味起到至關重要的作用。本研究從醬油發酵醪中分離得到1 株產4-EG的酵母菌株A10-2。采用微生物常規鑒定手段和分子生物學方法研究A10-2的種屬關系，初步鑒定其為W.versatilis。W.versatilisA10-2可以耐受18% NaCl，能利用阿魏酸合成4-VG，并可將4-VG還原為4-EG。在醬油發酵液中添加阿魏酸時，W.versatilisA10-2可以將4-EG質量濃度提高到對照組的19.1 倍。在成品醬油中添加高4-EG含量醬油發酵液，可顯著改善醬油醬香和醇香。上述結果顯示出W.versatilisA10-2在提升醬油4-EG含量、改善醬油香氣方面的巨大潛力。在大罐醬油發酵風味普遍偏弱的情況下，生物強化4-EG含量對于提升醬油品質有重要意義；因此，調控W.versatilisA10-2在醬油發酵醪中的生長和代謝，穩定實現醬油風味改良是下一步的研究重點。