江津津,嚴 靜,鄭玉璽,歐愛芬,任 芳,陳 慶,陳烽華
(1.廣州城市職業學院,廣東 廣州 510405;2.華南農業大學食品學院,廣東 廣州 510642;3.海能科學儀器有限公司,山東 德州 251500)
魚露又被稱為魚醬油,是一種歷史悠久,風味獨特的發酵調味品,是我國傳統食品中的瑰寶。早在公元前3世紀的《周禮》中就有對“魚醢”,即魚醬的記載。中國人開始制造和食用這種水產調味汁的時間遠早于歐洲和泰國等東南亞國家[1]。魚露是以海產低值魚為原料,與海鹽混合后經過腌漬和長期自然發酵后形成的紅褐色、澄清透亮的液體調味汁。由于風味濃郁獨特,魚露越來越廣泛地應用于餐飲行業和食品加工業,也被用作其他海鮮調味料的配料。廣東魚露是傳統魚露的典型代表,年產量達2萬 t左右,占全國魚露總產量的60%以上。
魚露原產自我國廣東潮汕和福建等地,由早期華僑傳到其他東南亞國家。目前生產和食用魚露的地區主要分布在東南亞、日本、菲律賓北部及中國東南沿海等地。不同產地的魚露因原料、工藝等差別而呈現出風味差異,其揮發性風味是品質的關鍵指標和特征。揮發性風味的差異可以采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜(headspace-solid phase microextraction gas chromatographymass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)、頂空-氣相離子遷移譜(headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry,HS-GC-IMS)以及電子鼻氣味指紋技術綜合評價,再結合感官量化描述分析(quantitative description analysis,QDA)和相對氣味活度值(relative odor activity value,ROVA)進行研究[2-4]。
魚露作為一種傳承至今的傳統調味品,其風味值得探究,但相關深入研究不多[5],對我國不同產地魚露的風味差異和特征的研究更少。魚露風味形成機理復雜,與具體工藝直接相關。本研究采用HS-GC-IMS、電子鼻、HS-SPME-GC-MS、氨基酸分析儀以及QDA等現代風味分析手段對不同產地魚露的特征風味差異進行比較分析,并結合ROVA進行探究,建立不同產地魚露的風味指紋圖譜,以期為魚露的風味檢測、品質評定和質量調控提供理論支撐。
用于分析測試的魚露樣品分別為不同產地的典型代表性產品,分別為汕頭魚露(汕頭魚露廠有限公司,n=2)、東莞魚露(東莞市永益食品有限公司,n=2)、福建魚露(福建省潘氏食品有限公司和福州民天集團有限公司,n=2)、泰國魚露(水媽媽牌和麗爾泰牌,n=2)和越南魚露(金蘇魚露和南漁魚露,n=2),分別購自廣東廣州和中國香港的超級市場。產品配料見表1。

表1 不同產地傳統魚露樣品及配料說明Table 1Ingredient descriptions of traditional fish sauce from different production areas
色譜用標準品及試劑 中國計量科學研究院化學所;其他試劑(均為分析純) 廣州市云薈貿易有限公司。
FlavourSpec?風味分析儀 德國G.A.S.公司;7890N-5977 GC-MS聯用儀 美國安捷倫科技有限公司;MOS電子鼻氣味指紋儀 法國阿爾法莫斯公司;S-433D型氨基酸分析儀 德國SYKAM公司;65 μm PDMS/DVB萃取頭、SPME進樣手柄 美國Supelco公司。
1.3.1 HS-GC-IMS條件
移取1 mL樣品直接置于20 mL頂空進樣瓶中,60 ℃孵育10 min后經頂空進樣用GC-IMS儀和FlavourSpec?風味分析儀進行測試,功能軟件分析給出樣品揮發性有機物的差異譜圖;軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫對物質進行定性分析。GC-IMS單元:分析時間20 min,色譜柱類型為FS-SE-54-CB-1(15 m×0.53 mm,1 μm),柱溫40 ℃,載氣/漂移氣為N2,漂移氣流量150 mL/min,IMS溫度45 ℃。自動頂空進樣單元:進樣體積300 μL,孵育時間10 min,孵育溫度60 ℃,進樣針溫度65 ℃,孵化轉速500 r/min。
1.3.2 HS-SPME-GC-MS條件
根據JY/T 021—1996《分析型氣相色譜方法通則》和GB/T 6041—2020《質譜分析方法通則》,室溫23 ℃、相對濕度65%條件下進行測定。SPME萃取條件:取樣品5 mL于25 mL樣品瓶,加入5 g NaCl,密封,水浴加熱50~55 ℃,電磁攪拌。用SPME纖維PA在樣品上空進行頂空萃取30 min,然后將纖維針頭縮于手柄中。使針頭插入GC進樣口250 ℃解吸3 min,吸附于針頭的有機物被轉移到色譜柱分析檢測。
GC-MS條件:HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升溫:起始溫度40 ℃,保持2 min,以5℃/min上升到125 ℃,最后以20 ℃/min上升至260 ℃。進樣口溫度250 ℃,以高純氦氣為載氣,流速1.0 mL/min,不分流。MS條件:接口溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;電子電離源;電子能量70 eV;質量掃描范圍30~400 u。
1.3.3 電子鼻氣味指紋分析
載氣為合成干燥空氣,流速150 mL/min,樣品量1.0 mL,頂空產生時間300 s,產生溫度40 ℃,攪動速率500 r/min,頂空注射體積1 000 μL;注射速率1 000 μL/s,注射針總體積2.5 mL,注射針溫度70 ℃,獲取時間900 s,延滯時間600 s。
軟件版本:Alpha_Soft Version 9.1軟件包,主要功能:控制自動進樣器HS 100;自動采集數據;化學計量學方法:主成分分析(principal component analysis,PCA)法等。
1.3.4 游離氨基酸分析
依據JY/T 019—1996《氨基酸分析方法通則》。室溫22 ℃,相對濕度56%,用SYKAM S-433D氨基酸分析儀進行測定。柱溫38~74 ℃;梯度升溫;色譜柱LCA K07/Li(15 cm);反應柱溫135 ℃;流動相為檸檬酸鋰,A pH 2.90、B pH 4.20、C pH 8.00;梯度洗脫;檢測波長為570 nm和440 nm;洗脫泵流速0.45 mL/min,衍生泵流速0.25 mL/min。
1.3.5 QDA
參照文獻[6]。由12 位志愿者組成感官評價小組,先對評價員進行篩選,排除海鮮過敏人員和氣味判斷異常人員,對評價員風味品評培訓后開始測評,每次評定獨立進行,環境一致,評定員間無干擾。對樣品的腌漬味、魚腥味、氨味、油脂酸敗味、肉香味、奶酪味、酸味等作出評分,分數由0~2.0給出,“0”代表沒感覺到此味道,“2.0”代表此種味道濃厚。按照差異分析評分(ANOVA)的方法,對不同樣品進行感官評定,共進行3 次實驗。
1.3.6 ROAV的計算
ROAV用于評價各物質對魚露風味的貢獻[7]。定義對魚露整體風味貢獻最大的組分的ROAVstan為100,其他揮發性化合物ROAVi按下式計算:

式中:Ti、Cri分別為各組分相應的感覺閾值/(μg/L)和相對含量/%;Tstan、Crstan分別為對樣品整體風味作出貢獻最大組分相對應的感覺閾值/(μg/L)和相對含量/%。
采用SPSS 12.0和Excel進行數據處理,差異性分析(ANOVA)檢查各個不同結果平均值間的顯著性差異,采用6 個平行,取95%置信度(P<0.05,差異顯著)。
各地傳統魚露的生產工藝大體相似,一般包括腌制、自溶(前期發酵)、日曬夜露(中期發酵)、后期發酵、過濾、勾兌、成品、包裝等,但不同產區的緯度和環境溫、濕度不同,使發酵進程和風味也不盡相同。廣東產區和福建產區屬于亞熱帶季風性氣候,泰國和越南屬于高溫多雨的熱帶季風性氣候,中國傳統魚露的加鹽量比泰國和越南都大[1,5],導致我國傳統魚露的生產周期是泰國魚露1.5~2 倍。各地魚露的生產工藝如圖1所示。


圖1 不同產地傳統魚露的生產工藝Fig.1 Flow chart for the production of traditional fish sauce from different production areas

圖25 種魚露樣品的GC-IMS圖Fig.2 GC-IMS spectra of fish sauce samples
用FlavourSpec?風味分析儀對魚露進行分析,通過Reporter插件快速查看樣品風味物質的差異;通過GalleryPlot插件得到指紋圖譜,PCA用于聚類分析。如圖2所示,數據點顏色越深,面積越大表示該化合物濃度越大,不同產地樣品的揮發性化合物的種類和含量有很大差異。越南魚露和泰國魚露的揮發性風味的相似度最大。東莞魚露風味物質濃度和種類明顯少于其他樣品。以粵式魚露代表“汕頭魚露”為標準,定性分析其所含特征揮發性化合物,框選關鍵化合物差異,形成指紋圖譜對比,見圖3,框中所示為樣品中差異較大的揮發性化合物,說明不同產地傳統魚露風味各有特色。

圖3 樣品揮發性有機物指紋圖譜對比圖Fig.3 Comparison of fingerprints of volatile organic compounds in fish sauce samples
從GC-IMS的定性結果可知,2-戊酮、丙酸乙酯、2-己醇是福建、越南、泰國魚露共有的揮發性有機物;(Z)-3-己烯醇、異戊酸、1-丁醇等物質為泰國魚露的特征性揮發物;異丁酸、丙酸乙酯、戊酸戊酯、環己酮等物質為越南魚露的特征性風味物質;丁酸乙酯、3-己醇、1-丁醇在東莞魚露中含量最高,但并非特征化合物;苯甲醛在汕頭魚露中含量最高,在其他樣品中含量非常少;2-丁醇、苯乙醛、2-甲基丁酸、丁酸乙酯、3-甲基丁醛、甲基硫化物為汕頭魚露特有的揮發性有機物。潮魚露定性出的特征揮發性有機物最多,東莞魚露中定性出的揮發性風味物最少。如圖4所示,F1和F2聚類在一起,相似度比較大,F3、F4與另3 類樣品的風味差異較大。

圖4 不同產地魚露的聚類分析Fig.4 Cluster analysis plot for discrimination of volatile flavor compounds in fish sauce from different production areas
通過GC-IMS分析,5 類樣品共定性出37 種主要揮發性風味物質,共6 大類。其中包括11 種醛類化合物、1 種含硫化合物、6 種酯類化合物、8 種醇、1 種苯、5 種酮、5 種酸。雖然醇類物質被檢出較多,但其閾值較高,不構成魚露揮發性風味的主體。黃紫燕等[8]研究表明,發酵初期酵母菌發酵產生的乙醇是最先快速增加的物質,但長期發酵后,乙醇可能被氧化成醛、酮類,進而被氧化成酸,轉化為其他物質,相對含量逐漸減少。故認為乙醇是魚露風味物質的前體。醛類化合物包括3-甲硫基丙醛、正丁醛、正己醛、3-甲基丁醛、苯乙醛、辛醛、2-甲基丁醛、苯甲醛、2-甲基丙醛、壬醛、己醛。樣品中均檢測到3-甲硫基丙醛,推測其為魚露特有腥臭氣味的來源。壬醛、辛醛、苯乙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、2-甲基丙醛均僅在汕頭魚露中檢出。其中,3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、2-甲基丙醛被報道具有堅果味[9],增強魚露特有的燒烤樣氣味,為汕頭魚露的特征香氣物質。直鏈醛如辛醛、己醛、壬醛具有魚腥味。其中,壬醛是魚腥味的主體物質[10],發酵過后壬醛含量有所降低,說明隨發酵時間的延長,魚腥味逐漸減少[11]。除F2、F3外,其余樣品均含有苯甲醛。苯甲醛具有愉快的杏仁香、水果香和堅果味,是由氨基酸的Strecker反應產生[12-14],也被認為是魚露的特征揮發性風味物質。定性出的酮類化合物包括3-羥基丁酮、2-丁酮、環己酮、2-戊酮、3-戊酮。酮類化合物的閾值較高,對魚露風味的貢獻較少。但也有研究表明,酮類物質對魚露特有魚腥味有一定的增強作用,特別是不飽和醛[15]。2-丁酮具有類乳香味,2-戊酮是形成干酪味的必需成分[16]。酸類特征化合物包括2-甲基丁酸、2-甲基丙酸、丁酸、異丁酸、丙酸、異戊酸。江津津等[17]研究表明,乳酸菌在發酵初期產生大量有機酸,能促進魚露特征風味中低揮發性酸的產生。低揮發性酸的閾值低,對魚露獨特風味的形成起一定作用[18]。據研究表明,魚露中的低揮發性酸如異戊酸、丁酸、丙酸構成了魚露的干酪味[19]。2-甲基丁酸、2-甲基丙酸僅在汕頭魚露中檢出,賦予其獨特的奶酪味。酯類物質包括3-甲基丁酸乙酯、3-乙酸異戊酯、丙酸乙酯、戊酸戊酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯。酯類物質閾值較低,多呈花香和果香味,能賦予魚露獨特的酯香味。
HS-SPME-GC-MS檢測到的揮發性化合物與質譜數據庫進行比較,識別出相似度超過85%的組分保留。如表2所示,共鑒定出47 種主要揮發性化合物,包括酸、醛、醇、烷烴類及芳香化合物。檢測出的8 類化合物中,酸類在汕頭魚露和越南魚露中占比78.13%和42.92%。含氮化合物在越南魚露中占比較大,醇類在福建魚露中占比較大(34.36%),泰國魚露中含量較多的是芳香類物質。酸類化合物主要是脂肪酸甘油三酯發生氧化反應或微生物對氨基酸的發酵作用而產生[20],由于大多數酸類的閾值較高,對魚露主體風味的貢獻值不大。但低分子質量的揮發性酸對魚露的整體特征風味有一定貢獻,如丁酸、丙酸、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸等揮發性酸是構成魚露“奶酪味”的主要物質[21]。汕頭魚露中檢測出6 種有機酸,其中丁酸、乙酸、3-甲基丁酸的含量較高。王悅齊等[12]研究發現,乙酸在所有發酵階段均被檢出,且低濃度的乙酸具有柔和的酸味,故認為有機酸對魚露的“奶酪味”形成有一定影響。

表2 關鍵揮發性成分及相對含量Table 2Key volatile components and relative contents in fish sauce samples
醛類化合物是通過不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下降解產生[22],這些醛類揮發性化合物一般具有較高的閾值和愉快的氣味,如麥芽香味、青草味、奶酪味和水果香味[23]。汕頭魚露的醛類揮發性物質占比最多,共檢測出5 種醛類物質,占11.56%。其中2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛對魚露的“肉香味”有重要的貢獻[24]。苯甲醛是由美拉德反應進程中的Strecker降解反應產生的,也是水產品中的一種特征風味物質。醇類主要是由氨基酸、碳水化合物和脂肪氧化代謝產生[25],乙醇在汕頭魚露和福建魚露均檢出,具有酒香味,在福建魚露中含量最高,在越南魚露中的含量最低。酯類物質產生于魚露發酵過程中酸類和醇類物質的酯化反應,主要為乙酯類化合物,主要與發酵中產生的高濃度乙醇有關[26-27]。汕頭魚露中酯類含量最小,僅檢出乙酸乙酯。酮類化合物的產生與氨基酸降解或脂肪酸的氧化有關[28],除了汕頭魚露,苯乙酮在其他魚露中均有檢出。汕頭魚露的含硫化合物含量相對最高,為2.19%。發酵過程中蛋白質水解,游離氨基酸生成,醇類不斷轉化,酸類逐漸增加,最后形成含硫、氮化合物[29]。含硫化合物的閾值較低,風味顯著,與魚露獨特的刺鼻味有關[30],對整體風味有影響。汕頭魚露中的含硫化合物有二甲基三硫(1.31%)、二甲基二硫(0.54%)、3-甲硫基丙醛(1.65%)。二甲基硫化物、3-甲硫基丙醛是魚露肉香味的主要來源[31],也是汕頭魚露風味特征之一。含硫化合物由含硫氨基酸轉化而來,比較氨基酸和特征化合物結構式不難推測,3-甲硫基丙醛源于甲硫氨酸,二甲基二硫和三甲基三硫源于半胱氨酸。含氮化合物主要來源于蛋白質降解或美拉德反應。越南魚露的含氮化合物含量較高,主要以吡嗪類和呋喃類為主,雖然含量不高,但其閾值較低,是魚露特征風味的重要組成。

續表2
為進一步確認魚露的關鍵揮發性風味化合物,采用ROAV法。由表3可知,根據所測魚露風味的相對含量和閾值,確定2-甲基二硫在汕頭魚露中對總體氣味貢獻最大。雖然2-甲基二硫相對含量不高,但其閾值極低,為0.000 005 mg/L,故確定2-甲基二硫的ROAV為100。一般認為,0.1≤ROAV≤1的物質對整體風味起修飾作用;ROAV>1的物質對整體風味起關鍵性作用[31-32]。

表3 魚露主要揮發性成分的ROAVTable 3ROAV of major volatile components in fish sauce
故認為魚露的關鍵風味成分為丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、苯甲醛、2-甲基二硫、2-甲基三硫、3-甲硫基丙醛。
電子鼻通過電子傳感器檢測和識別復雜氣味,已應用于新鮮度檢測、質量檢測和摻假檢測等食品評價領域[4]。如圖5A所示,PC1貢獻率為97.878%,PC2貢獻率為0.968 1%,PC1和PC2的累計貢獻率達到98.846 1%,幾乎包含了樣品的全部信息,可很好地表征各樣品間的差異性。不同區域代表不同樣品的整體氣味特性分布,不同區域間的距離表明樣品間的差異性。由圖5B可以看出,利用電子鼻響應值PCA可很好地區分不同魚露樣品,差異顯著,其中泰國魚露、越南魚露和汕頭魚露的揮發性氣味較類似,與福建魚露和東莞魚露的氣味有較大差異。這個結果也與GC-IMS的聚類分析結果吻合。

圖5 樣品風味感應的PCA統計(A)和聚類分析(B)Fig.5 Principal component analysis plot (A) and cluster analysis plot (B)for flavor discrimination of fish sauce samples
氨基酸是魚露中重要的呈味物質和揮發性化合物的前體[33]。由表4可以看出,泰國魚露含有23 種游離氨基酸,福建魚露和越南魚露各含有24 種和25 種游離氨基酸,東莞魚露和汕頭魚露各含有18 種游離氨基酸,總含量大小排序為越南魚露>汕頭魚露>泰國魚露>福建魚露>東莞魚露。除東莞魚露的天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和福建魚露的酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸未達到閾值外,其余樣品中氨基酸含量均達閾值以上。東莞魚露中的呈鮮味氨基酸占比高達93.84%,其中天冬氨酸占0.486%、谷氨酸占93.35%。天冬氨酸、谷氨酸是使魚露呈鮮味的重要提供者,含量愈多,鮮味愈濃。魚露中的魚肉降解為鳥苷酸、肌苷酸等核苷酸能與谷氨酸發生協同反應,均對魚露中的鮮味產生影響[34]。脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸等為甜味氨基酸,帶有少許酸味,構成復雜甜味。泰國魚露的甜味氨基酸占比例最高,為32.38%;東莞魚露占比最少,為1.74%。汕頭魚露中支鏈氨基酸占比為21.79%,為5 個樣品之最。支鏈氨基酸如亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸的代謝途徑被認為是魚露產生香氣物質的主要途徑[16],且纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸是魚露短鏈揮發性酸和醇的前體物質[29],對魚露特色風味的形成具有重要影響,這也合理解釋了樣品中揮發性酸含量的差異。汕頭魚露中的含硫氨基酸含量最高,占比4.34%。含硫氨基酸被認為對熟肉香味的形成有重大貢獻。甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸等是魚露中含硫揮發性風味物(3-甲硫基丙醛、二甲基硫醚、二甲基二硫等)的主要來源。這些揮發性含硫化合物是由魚肌肉中甲硫氨酸和半胱氨酸經微生物降解而成,為汕頭魚露的特征風味物。?;撬嵩谏穷^魚露的占比最高,為2.85%;東莞、福建、越南、泰國魚露分別占比0.075%、1.54%、1.54%、1.06%。

表4 不同產地魚露的游離氨基酸含量Table 4 Contents of free amino acids in fish sauce from different production regions mg/100 g
如圖6所示,汕頭魚露的酸味和奶酪味更加顯著,腌漬味更濃重而氨味則不及福建魚露、越南魚露和泰國魚露。福建魚露的氣味與其他魚露有明顯不同,表現為味道清淡許多,少了刺鼻味,其風味輪廓也與其他樣品有很大差異。泰國魚露QDA圖最為豐滿,越南魚露和汕頭魚露的QDA輪廓極為近似。QDA結果與GC-IMS結果有很大的一致性,也說明電子鼻和GC-IMS都能較好識別樣品間的揮發性風味差異,電子鼻氣味指紋更加直觀地展示差異,而GC-IMS則能有效定性出不同樣品的特征風味化合物。

圖6 魚露風味的量化描述感官分析Fig.6 Quantitative description and sensory analysis of flavor characteristics of fish sauce
本研究對不同產地傳統魚露的揮發性風味化合物及其風味特征進行了全面的比較分析,GC-IMS和電子鼻都能較好地識別樣品揮發性風味差異。電子鼻氣味指紋能更直觀地展示整體風味差異,GC-IMS能有效定性出樣品的特征風味物。GC-IMS、電子鼻和QDA都發現泰國魚露、越南魚露和汕頭魚露有著相似的整體風味,另2 種則差異大。
GC-IMS共鑒定出37 種特征風味化合物,主要包括醛類、醇類、酯類、酸類及含硫化合物等,汕頭魚露定性出的特有揮發物最多,東莞魚露定性出的揮發性風味物最少,2-戊酮、丙酸乙酯、2-己醇是福建、越南、泰國魚露共有的揮發性有機物;(Z)-3-己烯醇、異戊酸、1-丁醇等物質為泰國魚露的特征揮發性物質;異丁酸、丙酸乙酯、戊酸戊酯、環己酮等物質為越南魚露的特征風味物;丁酸乙酯、3-己醇、1-丁醇在東莞魚露中含量最高,但并非特征風味物;苯甲醛在汕頭魚露中含量最高,在其他樣品中含量非常少;2-丁醇、苯乙醛、2-甲基丁酸、丁酸乙酯、3-甲基丁醛、甲基硫化物為汕頭魚露特有的揮發性有機物。
HS-SPME-GC-MS共鑒定出47 種主要揮發性化合物。酸類在汕頭魚露和越南魚露中占比78.13%和42.92%。含氮化合物在越南魚露中占比較大,醇類在福建魚露中含量最高(占34.36%)。在越南魚露中的含量最低。泰國魚露中含量較多的是芳香類物質。含氮化合物(吡嗪類和呋喃類)和酯類在越南魚露中含量最高,是特征風味物。汕頭魚露的含硫化合物含量相對最高,是特征風味物,包括甲基硫化物和3-甲硫基丙醛。
氨基酸是揮發性風味物的前體,游離氨基酸總含量排序為越南魚露>汕頭魚露>泰國魚露>福建魚露>東莞魚露,但東莞魚露中呈鮮氨基酸占比最高(谷氨酸占93.35%),這與其配料里面添加了谷氨酸鈉有關。泰國魚露的甜味氨基酸占比例最高。汕頭魚露的含硫氨基酸和?;撬岷孔罡?。甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸等是魚露中含硫化合物的主要來源。游離氨基酸的差異從另一個角度詮釋了揮發性特征物的差異。