大型發酵醬油釀造過程中風味物質的動態變化分析

劉曉艷，葉月華，錢 敏,2，白衛東,*，黃漢聰，楊 紅，何一龍

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統食品加工與安全控制重點實驗室，廣東 廣州 510225；3.現代農業工程創新研究院，廣東 廣州 510225；4.廣州市如豐果子調味食品有限公司，廣東 廣州 510300）

醬油是我國經久不衰的傳統調味品，流傳歷史長達兩千余年，至今在人們日常飲食中仍占據著無可取代的地位。它的精髓源自于其獨一無二的風味，即香味和滋味等方面，主要是由一系列微生物在釀造過程中共同作用所形成復雜的物質組分。由于風味成分含量會隨著醬醪發酵過程中原料和微生物菌群的變化以及某些成分間的相互反應而有所改變，醬油的品質與發酵時間息息相關[1]。其中頗具代表性的是高鹽稀態醬油，耐鹽微生物能夠充分發揮作用，產生大量醇類、酯類和有機酸等風味物質，因此其醇厚的口感和濃郁的酯香深受大眾青睞，但不足之處是釀造周期長和成本高[2]。現代工藝為了確保大產量和縮短發酵周期從而通過機械化生產高鹽稀態醬油，這勢必會成為中國醬油行業未來發展的趨勢[3]。

醬油獨特的釀造工藝和具有特殊的風味，使其風味成分的研究一直以來備受學術界的廣泛關注。迄今，國內外學者主要采用直接溶劑萃取法、同時萃取蒸餾法和固相微萃取法等萃取方法結合高效液相色譜、氣相色譜和氣相色譜-質譜等方法對醬油揮發性成分進行分離和鑒定[4]。其中最常使用的是基于分析速度快、靈敏度高和可同時進行分離和鑒定等特點的氣相色譜-質譜法，例如高獻禮[5]利用固相微萃取結氣相色譜-質譜聯用技術對高鹽稀態醬油發酵過程中的香氣物質進行分析，共鑒定出74 種物質，其中最突出的香氣化合物有乙酸和3-甲基丁酸；李楊等[6]則采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜法測定出當地醬油發酵過程中揮發性香氣組分共計31 種。Wei Quanzeng等[7]也是使用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜法動態追蹤醬油不同發酵階段揮發性物質的變化，結果鑒定出119 種揮發性化合物。

然而當前針對醬油釀造過程風味成分變化規律的文獻相對較少，且對大型發酵醬油滋味層面物質的分離和鑒定尚未深入研究，目前有關醬油揮發性成分的研究報道也多集中于氣相色譜-質譜方法[8-9]。相比傳統質譜分析，高分辨率的飛行時間質譜則存在更多優勢，比如靈敏度和采集速率更高，可在極短時間內快速完成同等測量工作，選擇性更突出，操作更簡便，定性范圍更廣，尤其是分析組分復雜的樣品等方面[10-11]。因此，為了更好地指導高檔醬油的生產以及提高我國醬油的國際競爭力，本實驗率先采用氣相色譜-飛行時間質譜（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）技術對高鹽稀態醬油在機械化釀造過程中風味物質的動態變化進行更全面有效的分析，并獲得醬油在釀造過程中的重要風味組分，以期為今后該領域的相關科研工作者和醬油生產企業提供更充足的理論依據及數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取自廣州市如豐果子調味食品有限公司醬油發酵車間同一批次不同發酵時間的醬油樣品，分別是釀造第1、11、21、32、52、62天的醬醪樣品，發酵周期為62 d。

甲醇（67-56-1，色譜純） 美國CNW Technologies公司；吡啶（110-86-1，色譜純） 美國Adamas公司；甲氧銨鹽（593-56-6，分析純） 美國TCI公司；L-2-氯苯丙氨酸（103616-89-3，純度≥98%）上海恒柏生物科技公司；硅烷化試劑（1%三甲基氯硅烷，V/V） 美國REGIS Technologies公司；飽和脂肪酸甲酯 美國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀、DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國Agilent公司；PEGASUS HT質譜儀 德國Leco公司；Heraeus Fresco17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 物質提取

取樣本100 μL于1.5 mL EP管中，加入400 μL甲醇提取液，再加入10 μLL-2-氯苯丙氨酸，渦旋30s；超聲10 min（冰水浴）；將樣本4 ℃、12 000 r/min離心15 min；小心移取50 μL上清液于1.5 mL EP管中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶，20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min；向每個樣品中加入100 μL硅烷化試劑（含有1%三甲基氯硅烷，V/V），將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL飽和脂肪酸甲酯（溶于氯仿）；隨機順序上機檢測。

1.3.2 GC-TOF-MS測定

GC條件：進樣量1 μL；采用不分流模式；隔墊吹掃流速3 mL/min；載氣He；DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；柱流速1 mL/min；升溫程序：50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫到310 ℃，保持8 min。

TOF-MS條件：進樣口溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度250 ℃；電子能量－70 eV；質量掃描范圍m/z50～500，掃描速率12.5 spectra/s，溶劑延遲時間6.17 min。

1.4 數據處理及作圖

使用ChromaTOF軟件（V4.3x，LECO）對質譜數據進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[10]。物質定性使用LECO-Fiehn Rtx5數據庫，包括質譜匹配及保留時間指數匹配。采用Excel 2010作圖，TBtools 1.04繪制熱圖，SPSS 22.0對實驗數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果為3 次重復實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 醬油釀造過程中風味化合物的鑒定

如圖1所示，本次實驗中共檢出523 個峰。通過相似度檢索，從醬油樣品中共鑒定出了210 種成分。根據化學結構的差異，可將它們分為12 類，分別為氨基酸及其衍生物、有機酸、糖類及其衍生物、醇類、胺類、酚類、酮類、酯類、醛類、烴類、鹽類及其他。其中氨基酸及其衍生物有49 種，有機酸有47 種，糖類及其衍生物有30 種，醇類有19 種，胺類有18 種，酯類有9 種，酮類有4 種，醛類有3 種，烴類有3 種，酚類有1 種，鹽類2 種，其他25 種。以下把含量甚微且種類少的揮發性化合物歸為其他類物質，由此得到氨基酸及其衍生物、有機酸、糖類及其衍生物、醇類、胺類和其他類共7 大類物質。

圖1 不同時期醬油樣品的GC-TOF-MS總離子流圖Fig.1 GC-TOF-MS total ion current chromatograms of soy sauce mesh samples at different fermentation times

整個釀造周期不同釀造時間點的6 份醬醪樣品中種類最多的為氨基酸及其衍生物（31.235%～71.830%）和有機酸（12.839%～22.345%），其次是胺類（1.348%～3.340%）和其他類化合物（2.502%～3.880%），而糖類及其衍生物（1.720%～39.289%）和酯類（0.123%～0.480%）在釀造后期變化最大。醇類化合物在這一釀造階段中變化不太明顯。

2.2 醬油釀造過程中風味物質的組成

由圖2可知，在發酵初期，檢測出的風味物質的種類有175 種；第11～32天，風味化合物的種類變化有所上升，最高有198 種；第32～52天時，其風味化合物的種類稍有下降，有189 種，此時各風味物質的總相對含量持平，變化不大；但到第62天化合物種類急劇下降至54 種。醬油釀造過程中風味物質的種類前中期呈現上升趨勢，末期持續下降。說明在醬油釀造期間，其主要風味物質的形成是在釀造前中期產生的。發酵末期風味化合物種類的減少，可能是這個階段又有酵母菌參與賦香發酵，在增加風味成分的同時難免會抑制某些化合物之間的反應，從而導致成品中化合物的種類有所減少[12-14]。

圖2 醬油不同釀造時間風味物質的相對含量及化合物數量Fig.2 Changes in relative contents and types of flavor substances in soy sauce mesh with fermentation time

釀造過程中，氨基酸及其衍生物在前11 d呈現快速增加的趨勢，之后增加趨勢變緩。由于醬醪中的主力菌種是米曲霉，發酵前期米曲霉產生的大量蛋白酶分解原料蛋白，使氨基酸及其衍生物快速累積；第11天后曲霉的生長基本停止，但醬醪中的酶仍發揮作用[15]，因此氨基酸及其衍生物相對含量增長變緩。整個發酵過程中丙氨酸和亮氨酸含量增加明顯，它們對醬油的鮮味產生重要的影響，鮮味是醬油中最突出的味道[16]。

有機酸和糖類及其衍生物的相對含量則呈現下降趨勢。醬油中有機酸主要由乳酸菌發酵、酵母菌發酵、脂肪酸降解和氨基酸降解后氧化還原產生，醬油釀造過程中由于乳酸和L-蘋果酸的相對含量明顯降低而造成有機酸總相對含量下降，很可能是后期乳酸菌和酵母由于競爭營養素和產生的特殊代謝產物互相抑制生長從而降低了有機酸的含量[17]。糖類及其衍生物是發酵過程中微生物進行生命活動的底物和能量來源，而微生物的生命活動始終貫穿整個醬油釀造過程，所以醬油中糖類及其衍生物整體相對含量不斷減少[18]。醬油發酵過程中糖類及其衍生物含量大幅度下降主要源于果糖、核糖、龍膽二糖等化合物含量的降低。

醇類物質可以為醬油帶來醇的酒香氣味和一種怡人的花草香氣[19]。釀造過程中醇類化合物的相對含量呈現先升高后降低的變化趨勢，其中含量變化較大的為肌醇。釀造第1天醇類化合物的相對含量為1.664%，到第32天增加到2.728%，這時的醇類物質主要來源于酵母乙醇發酵和氨基酸的代謝，后又下降至2.000%，可能是因為醇類物質會與有機酸反應生成重要的酯類物質。

釀造過程中的胺類物質和酯類物質含量在全部風味成分中占比不大，其他風味成分在發酵過程中也不斷累積，因此它們的相對含量維持在一定范圍內。胺類物質主要是由微生物的氨基酸脫羧酶對游離氨基酸脫酸反應產生的，氣味刺激，容易造成醬油釀造初期時帶來的惡臭味[20]。

釀造過程中其他類化合物的相對含量呈現出增加的趨勢，其他類化合物雖然含量很低，但因為所包含的酮類、醛類、酚類等物質種類多從而豐富了醬油的風味層面。

2.3 醬油釀造過程中風味物質的熱圖分析及PCA

2.3.1 醬油釀造過程中風味物質的熱圖分析

氨基酸及其衍生物、有機酸和糖類及其衍生物等多種風味物質是評判醬油滋味的重要質量指標，酯類、醇類、胺類和一些其他物質如醛類、吡啶類等揮發性風味物質盡管含量甚微，但種類繁多，因此是構成醬油風味的重要物質來源。為了進一步研究釀造過程中風味物質的變化，選取在釀造過程中檢測到的含量變化較為突出的136 種風味物質并對其含量變化進行熱圖分析，可以直觀地表現出這6 個時期組分的差異，紅色越深代表含量越高，藍色越深則代表含量越低，結果如圖3所示。

圖3 醬油釀造過程中風味物質含量變化的熱圖Fig.3 Heatmap showing changes in the contents of flavor components in soy sauce mesh during the brewing process

從圖3A可以看出，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、乳酸、L-蘋果酸、3-氨基異丁酸、鳥氨酸、核糖和果糖這13 種化合物在釀造過程中含量的變化是比較明顯的，說明這13 種化合物對醬油的風味有著至關重要的影響。丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸在整個釀造過程中的含量不斷增加，甘氨酸的含量在釀造前期有所增加，中期開始減少，但在末期時增加到最大值。丙氨酸和甘氨酸能夠為醬油提供甜味和鮮味[21]，能增強醬油的調味效果，還能改善醬油中有機酸的酸味，使醬油風味變得柔和，起到味感緩沖作用；而纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸呈苦味，微量的苦味能給醬油增添醇厚感，賦予醬油獨特的風味[22-23]。脯氨酸、乳酸、L-蘋果酸、核糖和果糖的含量則在整個釀造過程中呈現下降的狀態，但L-蘋果酸相對含量最高，L-蘋果酸酸度比檸檬酸大，酸味大卻柔和，具有持久性[24]；核糖和果糖等糖類及其衍生物主要由淀粉酶解生成，是醬油甜味的主要來源，能對醬油滋味有一定的緩沖作用，還能與氨基酸等一同起風味協調作用[25]。而3-氨基異丁酸和鳥氨酸在釀造前期含量不斷增加，到釀造后期開始持續減少。其他氨基酸及其衍生物、有機酸和糖類及其衍生物等含量在釀造過程中增加和減少的趨勢與這13 種化合物相比則較為緩慢。

從圖3B可以看出，酯類、醇類、胺類等物質中，2-羥基吡啶、1,5-脫水葡萄糖醇、肌醇、乙醇胺和尿嘧啶這5 種化合物在釀造過程中含量的變化比較明顯，其中，2-羥基吡啶在釀造前期含量先減少，隨著釀造時間的延長，到釀造后期又逐漸增加。1,5-脫水葡萄糖醇在釀造前期變化大，但在釀造后期含量大幅減少。肌醇、乙醇胺和尿嘧啶在整個釀造過程中含量不斷增加，增加的速度與其他化合物相比較為迅速。醇類和酯類物質明顯能賦予醬油濃郁的醇香和酯香[26]，還可抑制發酵必然產生的胺類化合物所帶來的刺激感和苦味，因此揮發性物質的作用不可小覷[27-29]。

2.3.2 不同釀造時期醬油風味物質的PCA

對不同釀造時間高鹽稀態醬油的風味物質相對含量值標準化后，利用PCA方法對其原始數據進行降維處理[30-32]，從氨基酸及其衍生物、有機酸、糖類及其衍生物、酯類、醇類、胺類和其他物質共7 大類物質中提取出2 個PC（特征值＞1），如表1所示。PC1貢獻率為51.52%，PC2貢獻率為39.34%，所提取的2 個PC總貢獻率達到90.86%，能充分客觀地反映醬油釀造過程中風味物質的變化趨勢。

表1 PCA的特征值及其貢獻率Table 1Eigenvalues of first two principal components and their contribution rates

如圖4A所示，在PC1軸上，氨基酸及其衍生物、醇類及酯類物質呈正相關，而糖類及其衍生物呈負相關，氨基酸及其衍生物及糖類物質是醬油中鮮味及甜味的主要來源，說明PC1反映了醬油主要特征風味化合物在釀造過程的影響；PC2軸顯示，有機酸、胺類、酯類及其他類物質的相關性系數較大，因此可用PC2解釋這4 類物質，主要反映醬油中起修飾性的酸味及香味化合物在釀造過程的影響。

圖4 醬油樣品的載荷圖（A）和得分圖（B）Fig.4 PCA loading (A) and score (B) plots for soy sauce mesh samples at different fermentation times

從圖4B可以看出，所有樣品在橫軸上的投影較遠，說明發酵過程對于醬油的鮮甜味有較強相關性。對于同一釀造階段的樣品在PC1上投影距離大于在PC2的投影距離，說明PC1對同一釀造階段的樣品有更好的解釋能力，發酵過程對氨基酸及其衍生物和糖類及其衍生物的影響較大。

而在PC2軸上，第1天的樣品與其他釀造時間的樣品距離較遠，說明第1天的樣品與其他樣品的差異性較大。除第21天的樣品，釀造前期的樣品都分布在PC2軸上方，而釀造后期的樣品都分布在PC2軸下方，說明PC2能較好地區分前酵和后酵期間的風味組分，有機酸、胺類、酯類和其他類物質對不同釀造階段的樣品解釋能力較大。

3 結 論

大型發酵高鹽稀態醬油在機械化生產過程中可對釀造過程的溫度等環境條件進行人工控制，能夠確保醬油產量和品質的同一性。本實驗對大型發酵醬油釀造過程進行跟蹤取樣，采用GC-TOF-MS技術對高鹽稀態醬油釀造過程中風味物質的動態變化進行監測，利用PCA法對不同釀造時間醬醪樣品的風味物質進行分析。

氨基酸及其衍生物是醬油中含量最多的風味化合物；不同釀造時間段醬醪樣品中的化合物種類不斷減少，其相對含量變化也較明顯。發酵前11 d，氨基酸及其衍生物的相對含量迅速增加，而糖類及其衍生物、有機酸的相對含量快速減少；之后，氨基酸及其衍生物、糖類及其衍生物、有機酸的變化趨勢變緩。醇類、酯類、胺類物質和其他類物質的相對含量在發酵過程中變化不大。熱圖分析表明，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、乳酸、L-蘋果酸、3-氨基異丁酸、鳥氨酸、核糖、果糖、2-羥基吡啶、1,5-脫水葡萄糖醇、肌醇、乙醇胺和尿嘧啶在釀造過程中含量的變化始終比較明顯，說明這18 種化合物對醬油風味有至關重要的影響。從不同釀造時間醬醪樣品的風味物質中提取的2 個PC的累計貢獻率達到90.86%，結果顯示所有樣品與PC1呈較好的相關性，表明發酵過程對貢獻醬油鮮甜味的氨基酸及其衍生物和糖類及其衍生物影響較大。第1天樣品與PC2呈較好的相關性，表明第1天樣品對貢獻修飾風味的有機酸、胺類、酯類其他類物質影響也較為顯著。