蛋白含量對牦牛乳清蛋白濃縮物功能特性的影響

高瑞平，梁 琪*，白莉莉

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

干酪生產過程中會產生副產物乳清廢液[1]，而廢液中的乳清蛋白是一種營養價值極高、具有多種功能特性的蛋白源[2]。這種生產干酪得到的乳清稱為甜乳清，另一種通過酸沉淀得到的乳清稱為酸乳清，也稱原乳清。商業化乳清蛋白產品主要以乳清蛋白濃縮物（whey protein concentrate，WPC）和乳清蛋白分離物（whey protein isolation，WPI）為主，超濾是目前用于生產WPC和WPI的核心技術手段，可以制備出不同蛋白含量的產品[3]。WPC由于其具有較好的功能特性，例如乳化性、起泡性等，已成為現代食品加工中重要的蛋白來源[4]。

國內外學者對各類WPC的功能特性進行了相關研究。Heino等[5]對原乳清蛋白濃縮物（native whey protein concentrate，NWPC）和甜乳清蛋白濃縮物（sweet whey protein concentrate，SWPC）功能特性的研究結果表明，干燥方式對WPC功能特性無顯著影響，SWPC溶解性、持水性和乳化性較好。Svanborg等[6]研究通過膜處理原乳清液得到WPC的起泡性和乳化性，結果表明，原乳清液可能是生產WPC的潛在來源，具有與通過干酪生產獲得的WPC相同的組成和功能性質。早期有學者對乳清蛋白純品以及乳清蛋白混入其他體系后乳化性進行研究[7]，結果表明決定其乳化特性的重要因素是蛋白質濃度、pH值、離子強度、鈣和乳糖濃度，以及加工條件和儲存條件[8]。Gazi等[9]對蛋白質質量分數在35%～87%的WPC的溶解性研究結果表明，WPC具有較好的溶解特性，隨著蛋白含量增加，溶解性也隨之提高。Sodini等[10]研究pH值和熱處理對酸奶中WPC功能特性的影響，結果表明熱處理的WPC可以提高酸奶的持水性能。

在工業生產過程中的熱處理環節，牛乳蛋白的物化性質及分子結構都會發生相應改變，從而影響產品質量，主要是由于在70 ℃以上溫度加熱時，引起乳清蛋白的熱變性，特別是β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）與κ-酪蛋白形成二硫鍵發生聚合附著在膠束表面[11]。楊楠等[12]研究對比了牦牛脫脂乳、純酪蛋白溶液經過不同溫度（30～90 ℃）的熱處理，兩者相關功能特性（熱穩定性、乳化性）的變化。結果表明隨著熱處理溫度的上升，由于乳清蛋白與酪蛋白的相互作用及酪蛋白自身發生離解、聚集過程，導致脫脂乳和酪蛋白溶液的熱穩定性下降、乳化性降低、濁度增大。

牦牛乳是青藏高原地區的優質乳源，近年來，隨著我國牦牛乳乳品企業的相繼建立，在加大乳產量的同時，產生的乳清廢液的利用管理成為牦牛乳品企業面臨的一大難題。目前市售荷斯坦牛乳的WPC產品，蛋白含量越高，價值也越高，廣泛應用于嬰兒配方奶粉、酸奶以及健身食品中，尤其嬰兒配方奶粉需要高蛋白含量的WPC，我國還依靠國外進口為主。對牦牛WPC的功能特性分析具有很高的研究價值。本實驗對不同截留分子質量膜處理獲取的牦牛WPC溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性等功能特性進行系統性比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳采自甘肅天祝縣抓喜秀龍鄉。所有有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SP-723紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；SH220N石墨消解儀 濟南海能儀器有限公司；SKD-200凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機、XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；QL-866旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；L500醫用離心機 湘儀離心機儀器有限公司；WTM-1812G卷式膜設備 杭州沃騰膜工程有限公司；再生纖維素RC型透析袋 上海源葉生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳主要成分及理化指標測定

蛋白質：參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法；乳脂肪：GB 5413.3—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪測定》中蓋勃氏乳脂計法測定；乳糖：SN/T 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的測定》中的分光光度計法；酸度：pH計進行測定。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 牦牛乳NWPC的制備

采用陳婷[13]和Macedo[14]等的方法作適當修改。鮮牦牛乳10 000 r/min離心30 min脫脂，調節pH 4.6等電點沉淀，3 500 r/min離心20 min，收集上清液，即為原乳清液，經截留分子質量3 500 Da的卷式膜超濾濃縮得到NWPC，直接真空冷凍干燥制取的粉制品即為NWPC1；濃縮液經5 000 Da的透析袋透析過夜，凍干得到NWPC2；濃縮液經10 000 Da的透析袋透析過夜，凍干得到NWPC3。

1.3.2.2 牦牛乳SWPC的制備

在實驗室條件下手工制作牦牛乳硬質干酪生產過程中收集的乳清廢液，經截留分子質量3 500 Da的卷式膜超濾濃縮得到SWPC，直接真空冷凍干燥制取的粉制品即為SWPC1；按照NWPC2和NWPC3相同步驟分布制取SWPC2、SWPC3。

1.3.3 WPC主要成分測定

蛋白質：參考GB 5009.5—2016中凱氏定氮法；乳糖：參考SN/T 0871—2012中的分光光度計法；酸度：pH計進行測定。

1.3.4 WPC功能指標測定

1.3.4.1 持水性和持油性的測定

采用Palatnik等[15]的方法作適當修改。持水性：用預先稱量過的離心管準確稱取2.0 g樣品，緩慢加水，每加幾滴水，用旋渦混合器混合幾分鐘，直至樣品呈漿狀且無水析出時為止，于10 000 r/min離心3 min，倒去上層清液，稱量。離心后若無上清液，再加水攪勻離心，直至離心后有少量上清液為止。持水性表示每克樣品中吸收水并保持水的質量，計算公式如下：

式中：m1為空試管的質量/g；m2為試管加樣品的質量/g；m3為沉淀物加試管的質量/g。

持油性：1 g（精確到0.001 g）樣品溶于含25 mL大豆色拉油的離心管，用旋渦混合器混合30 s。油混合物在4 200 r/min離心30 min。測定分離出的油體積，持油性表示為每克蛋白質樣品吸收油的體積，計算公式如下：

式中：V0為25 mL；V1為離心出油的體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.4.2 乳化性的測定

采用Pearce等[16]的方法作適當修改。取0.02 g/mL樣品溶液21 mL，邊攪拌邊加入純大豆色拉油9 mL，然后以10 000 r/min高速勻漿1 min制成乳狀液，乳狀液放置10 min，從玻璃容器底部取100 μL乳化液加入到5 mL、0.1%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中混勻，利用紫外-可見分光光度計于波長500 nm處測吸光度，用0.1%的SDS溶液為空白調零。乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定指數（emulsifying stability index，ESI）計算公式如下：

式中：C為樣品溶液濃度；φ為油相所占的體積分數（2%）；A500nm為500 nm波長處的吸光度；D為樣品稀釋倍數；A0為0時刻的吸光度；A10為10 min后的吸光度。

1.3.4.3 起泡性的測定

采用Motoi等[17]的方法作適當修改。取40 mL 0.02 g/mL的樣品，用內切式高速分散器在10 000 r/min攪打1 min，快速將泡沫轉移至量筒中，測量攪打后的泡沫體積和靜置10 min的泡沫體積。起泡能力用經攪打后蛋白質分散物的體積增加量表示。泡沫穩定性按下式計算：

式中：V0為攪打后泡沫的體積/mL；V10為放置10 min后的泡沫體積/mL；V為攪打前樣品溶液的體積/mL。

1.3.4.4 溶解性的測定

采用Luo等[18]的方法作適當修改。配制0.05 g/mL的乳清蛋白溶液，25 ℃恒溫振蕩1 h，10 000 r/min離心5 min，得上清液。用凱氏定氮法測定上清液的蛋白含量，每個樣品重復實驗3 次，溶解性按下式計算：

1.3.4.5 熱穩定性的測定

采用Meng等[19]的方法作適當修改，測定依據是在熱處理時蛋白在溶液中的溶解程度。將質量濃度為0.02 g/mL的乳清蛋白溶液分別在60、65、70、75、80、85、90、95 ℃水浴加熱30 min。取出后立即冰浴2 min，恢復至室溫。然后稱取熱處理后的溶液于2 500 r/min離心10 min，倒出上層溶液，稱取下層沉淀物質量，計算比較沉淀量與蛋白溶液的比例。沉淀量越大，穩定性越差。沉淀率計算公式如下：

1.4 數據統計

數據采用Origin 8.0與SPSS 17.0軟件進行處理，采用Duncan多重比較方法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳主要成分含量及理化指標分析

由表1可看出，牦牛乳蛋白含量和脂肪含量較高，其pH值約為6.55。

表1 牦牛乳中主要成分含量及理化指標Table 1Major components and physicochemical characteristics of yak milk

2.2 牦牛WPC主要成分分析

根據膜對不同蛋白質分子質量的截留程度選擇性過濾乳糖、礦物質、水分和低分子質量化合物等物質[20]。由表2可知，經同一膜處理的牦牛WPC乳糖含量無顯著差異（P＞0.05），pH值差異顯著（P＜0.05），蛋白質含量差異顯著（P＜0.05），牦牛NWPC1、NWPC2、NWPC3總蛋白質量分數分別為14.708%、31.778%、81.432%，牦牛SWPC1、SWPC2、SWPC3總蛋白質量分數分別為22.905%、38.680%、84.898%，經10 000 Da膜截留得到的牦牛NWPC3蛋白含量約為NWPC1的5.5 倍，NWPC2的2.6 倍，牦牛SWPC3蛋白含量約為SWPC1的3.7 倍，SWPC2的2.2 倍。Alsaed等[21]研究指出，產生這種蛋白差異主要原因是牦牛甜乳清液通過生產酶凝型硬質干酪獲得，添加的凝乳酶促進凝乳，凝乳酶切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，產生p-κ-酪蛋白和糖巨肽，p-κ-酪蛋白附著在酪蛋白膠束的表面進入干酪中，而糖巨肽則留在乳清液中，因此經同一規格膜處理的牦牛SWPC總蛋白含量高于牦牛NWPC總蛋白含量；不同膜處理的牦牛WPC其乳糖含量、蛋白含量存在顯著性差異（P＜0.05），隨著膜截留分子質量的增大，牦牛WPC乳糖呈顯著下降（P＜0.05），WPC3中均不含乳糖，蛋白質含量呈現上升的趨勢，說明蛋白純化效果顯著。

表2 WPC主要成分Table 2 Major components of WPCs

2.3 牦牛WPC溶解性分析

由圖1可知，隨著處理膜截留分子質量的增大，牦牛WPC的溶解性隨之增高，這主要因為隨著截留分子質量的增加，牦牛WPC蛋白質含量升高。De Castro-Morel等[22]研究得，同一pH值條件下，蛋白質含量的高低影響荷斯坦牛乳WPC的溶解性，WPC80的溶解性顯著高于WPC35。牦牛NWPC和SWPC的溶解性差異顯著（P＜0.05），用3 500 Da卷式膜和5 000 Da再生纖維素膜過濾得到的牦牛NWPC溶解性高于牦牛SWPC，這主要的原因是牦牛SWPC使用的干酪乳清液在制作干酪過程中經過了熱處理環節。有學者對荷斯坦牛乳蛋白粉的相互作用研究表明[23]，熱處理導致乳清蛋白和酪蛋白發生不同程度的聚集，聚集物主要是乳清蛋白和κ-酪蛋白之間以二硫鍵形式結合，形成酪蛋白膠束，使得乳蛋白粉溶解性降低，影響乳蛋白粉功能特性。該研究結果也闡明牦牛NWPC和牦牛SWPC在溶解性上的差異。用10 000 Da再生纖維素膜透析得到的牦牛WPC因其純度均較高，溶解性顯著增高，牦牛SWPC的溶解性顯著高于牦牛NWPC的溶解性，說明乳清蛋白含量越高，溶解性越高。

圖1 牦牛WPC的溶解性Fig.1 Solubility of yak WPCs

2.4 牦牛WPC持水性分析

由圖2可知，3 種不同截留分子質量膜處理獲得的牦牛NWPC持水性顯著高于SWPC，有研究報道[4]熱處理可以降低蛋白質和水的結合能力，同時因乳清蛋白是熱敏性蛋白，部分乳清蛋白變性聚集，降低了蛋白質和水的結合能力，從而降低了蛋白質的持水性能，外部因素對WPC內部結構和聚集狀態的影響同時決定其功能特性的變化[24]。隨著處理膜截留分子質量的增大，牦牛WPC持水性呈現顯著上升的趨勢，蛋白質含量的增高導致蛋白質-水作用增強，從而使得持水性增強。持水性是乳產品經常被需求的一種功能特性，工業上利用乳清蛋白的持水性能將其應用于肉類食品中，以提高肉類產品的保水性[25]。

圖2 牦牛WPC的持水性Fig.2 WHC of yak WPCs

2.5 牦牛WPC持油性分析

由圖3可知，3 500 Da卷式膜和5 000 Da再生纖維素膜過濾得到的牦牛NWPC和SWPC間無顯著差異（P＞0.05）；隨著處理膜截留分子質量的增大，牦牛WPC持油性顯著增高；蛋白質的吸油性是指蛋白質在一定加工條件下保持油脂的能力，是蛋白質的功能特性之一，乳清蛋白常作為脂肪類似物應用在肉類、焙烤食品中，WPC良好的持油性和持水性能對改善食品口感，包括硬度、黏度等物性指標有重要意義，有利于完善組織化產品的感官品質和功能品質[26]，同時這也是WPC的商業利用途徑之一。

圖3 牦牛WPC的持油性Fig.3 OHC of yak WPCs

2.6 牦牛WPC起泡能力和泡沫穩定性分析

由圖4可知，牦牛NWPC和SWPC起泡能力存在顯著差異（P＜0.05），Kamath等[27]研究不同處理溫度下荷斯坦牛乳脫脂乳泡沫界面物質組成的結果指出WPC在生產乳清液環節之前，牛乳經過巴氏殺菌處理，形成酪蛋白膠束，膠束和變性的乳清蛋白以二硫鍵結合，分散在氣泡表面，增強WPC的起泡能力。牦牛SWPC起泡能力顯著高于NWPC。隨著獲得的牦牛WPC蛋白含量的增高，起泡能力呈現顯著增高的趨勢，這與界面分散更多的蛋白分子有關，因此，高蛋白含量的牦牛WPC起泡能力較好。牦牛WPC泡沫穩定性隨著蛋白質含量的升高，變化趨勢和牦牛WPC起泡能力一致，該現象與有學者研究的不同物質對荷斯坦牛乳脫脂乳起泡性能改善的結果一致[28]，說明隨著牦牛WPC濃度的升高，泡沫穩定性表現顯著增強的效果。

圖4 牦牛WPC的起泡能力和泡沫穩定性Fig.4 Foam capacity and stability of yak WPCs

2.7 牦牛WPC乳化活性和乳化穩定性分析

由圖5可知，牦牛NWPC1和牦牛SWPC1有顯著差異（P＜0.05），隨著處理膜截留分子質量的增大，牦牛WPC的EAI呈現顯著增強的趨勢（P＜0.05），牦牛WPC的EAI增加趨勢和蛋白含量增加趨勢一致。牦牛SWPC的ESI顯著高于NWPC，差異主要來源于牦牛SWPC經過熱處理，Dybowska[29]對荷斯坦牛乳WPC研究結果表明，WPC經過不同條件下的熱處理，會發生不同程度的聚集行為，可能會產生穩定的納米顆粒和聚集體，聚集蛋白可能已經形成了較厚的蛋白質膜，因此這些小聚集體都可以穩定乳液；當蛋白液濃度增高時，分散相黏度較高，使脂肪流動最小化，從而延遲了乳化過程。當蛋白濃度越高時，不但增加了乳液的黏度，而且為脂滴涂布提供了更多的蛋白質，因此其ESI增高[30]。這和牦牛WPC的ESI變化趨勢一致，可以作為牦牛WPC的ESI變化的理論解釋。

圖5 牦牛WPC的EAI和ESIFig.5 EAI and ESI of yak WPCs

2.8 牦牛WPC熱穩定性分析

由圖6可知，牦牛WPC在60 ℃時均有沉淀產生，說明在60 ℃熱處理30 min牦牛WPC開始變性。牦牛NWPC2、NWPC3、SWPC2和SWPC3在70 ℃以上，沉淀率顯著增大（P＜0.05），85 ℃沉淀率最大，NWPC3、SWPC3沉淀率分別為0.424%、0.409%，85～95 ℃，沉淀率變化緩慢；牦牛NWPC1和SWPC1沉淀率變化緩慢，在85 ℃達到最大沉淀率，當熱處理溫度高于85 ℃沉淀率變化緩慢（P＞0.05）。Dickow等[31]對荷斯坦牛乳WPC的研究發現，荷斯坦牛乳WPC在60 ℃開始變性，β-Lg開始聚集；當熱處理溫度增加至70 ℃時，β-Lg肽鏈展開，在80 ℃熱處理時，β-Lg結構改變，開始變性，處理溫度到90 ℃以后，β-Lg全部變性。Brodkorb等[32]研究發現，荷斯坦牛乳乳清蛋白在80 ℃時最不穩定，當熱處理溫度達90 ℃時，熱穩定性趨于穩定，原因是α-La分子展開，疏水基團巰基大量暴露在分子表面，和變性β-Lg以二硫鍵交聯形成膠束，而形成的膠束物質具有較好的熱穩定性，熱穩定性趨于穩定。這與本實驗牦牛WPC熱穩定性的變化趨勢一致，但是實驗結果發現牦牛WPC的最不穩定溫度為85 ℃，高于荷斯坦牛乳WPC的80 ℃。牦牛SWPC1、SWPC2和SWPC3熱穩定性顯著高于牦牛NWPC1、NWPC2和NWPC3，說明加工干酪階段的熱處理會適當改善牦牛WPC的熱穩定性。

圖6 牦牛WPC的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of yak WPCs

3 結 論

不同截留分子質量膜生產得到不同蛋白含量的牦牛WPC主要成分和功能特性差異顯著，10 000 Da透析膜得到的牦牛NWPC和SWPC總蛋白質含量均達到80%以上，且無乳糖殘留，同時，其功能特性（溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性）均顯著高于其他膜分離得到的牦牛WPC，說明10 000 Da透析膜生產的牦牛WPC純度較高，其總蛋白含量高，功能特性突出，應用前景較好。獲取不同蛋白含量的牦牛SWPC其起泡能力、泡沫穩定性、乳化活性、乳化穩定性和熱穩定性均顯著高于NWPC，說明熱處理會適當改善牦牛WPC的起泡性能、乳化性能和熱穩定性，從而拓寬牦牛WPC的應用范圍；通過膜處理獲取蛋白含量較高的牦牛WPC，功能特性較好，應用領域廣泛，這對解決牦牛乳清資源的利用問題、保護環境、提高企業的經濟效益起到關鍵性作用。