枯草芽孢桿菌YZU-S149的分離鑒定及對西瓜枯萎病的生防作用

孫正祥，龍欣鈺，孟祥佳，曹帥，毛國慶，周燚

1.長江大學農學院，湖北 荊州 434025 2.湖北省農林病蟲害預警與調控工程技術研究中心(長江大學)，湖北 荊州 434025

由尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusariumoxysporumf. sp.niveum, FON)(病原真菌西瓜枯萎病菌)引起的西瓜枯萎病是一種土傳病害，是西瓜生產中發生最廣泛、危害最嚴重的病害之一，發病率較高，甚至可導致絕收[1]。西瓜枯萎病菌的厚垣孢子可以在土壤中生存長達10年，并且能夠在多種作物上生存，這給疾病控制帶來了困難[2,3]。目前尚無理想的防治方法，嫁接防治會影響西瓜的口感及品質，抗病品種培育周期長，且易喪失抗病性；化學農藥高劇毒高殘留，對人畜有毒害作用[4,5]。而生物防治相對安全有效，符合可持續性農業發展要求，因此利用微生物制劑防治西瓜枯萎病具有重要的實踐意義。近年來，利用生防菌株防治西瓜枯萎病已有不少相關報道，如非致病鐮刀菌(Fusariumspp.)[6]、芽孢桿菌(Bacillusspp.)[7]、綠色木霉(Trichodermviride)[8]和綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)[9]等。然而上述生防菌株大多數存在田間效果不穩定、貨架期短等問題[10]。對節白蠟(Fraxinushupehensis)首先發現于湖北，為中國特有種，具有重要的藥用價值，鮮有病蟲害發生[11]，推測其體內含有能產生抗菌活性物質的微生物，幫助其免于病蟲害為害。目前，國內外對對節白蠟的研究主要集中在園林園藝[12]、人工栽培[13]、化學成分[14]等方面，但對于對節白蠟內生菌的研究鮮有報道。為此，該研究從對節白蠟根部和根際土壤中分離篩選對西瓜枯萎病菌具有較強拮抗作用的細菌，測定其抑菌譜、生防特性及盆栽防效，以期為西瓜枯萎病生防制劑的開發與應用提供有效的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病原真菌西瓜枯萎病菌、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)和玉米莖基腐病菌(F.moniliforme)均由本課題組分離與保存。

西瓜品種為西農八號，由西北農林科技大學選育。培育西瓜所用的基質土為長江大學農學院自行研發的育苗專用土。

培養基包括營養肉湯培養基(NB)及其固體培養基(NA)、馬鈴薯葡萄糖培養基(PDB)及其固體培養基(PDA)、幾丁質酶檢測培養基[15]、蛋白酶檢測培養基[16]、纖維素酶檢測培養基[17]、嗜鐵素檢測培養基[18]。

1.2 西瓜枯萎病生防菌株的篩選及其生防特性的測定

1.2.1 生防菌株的分離與純化

稱取1g對節白蠟幼根組織，采用75%的酒精浸泡1min，4%的NaClO浸泡 5min，將消毒后的根部組織用無菌水沖洗3次后于無菌研缽中充分研磨，取所得研磨液依次稀釋至10-4、10-5和10-6，每個濃度取100μL涂布于NA平板。另取對節白蠟根際土約10g，倒入100mL三角瓶中并加入90mL無菌水，于130r/min、28℃條件下培養30min制成母液。將母液依次稀釋至10-6、10-7和10-8，分別取100μL稀釋液涂布于NA平板。將上述平板置于培養箱中，28℃恒溫培養，每個濃度重復3次。2～3d后挑取形態、顏色和大小等不同的單菌落，轉接至斜面培養基中，4℃保存備用。

1.2.2 拮抗菌株的篩選及抑菌譜的測定

1)初篩。將PDA平板上培養5d的西瓜枯萎病菌菌餅(6mm)置于PDA平板中央，在距離菌餅中心2.5cm對稱劃線接種待測菌株，28℃恒溫培養，4d后測量抑菌帶的大小。

2)復篩。采用平板對峙法，挑取培養了5d的西瓜枯萎病菌菌餅接種至PDA平板中央，在與平板中央等距離的3點處用無菌打孔器對稱打孔，向孔中注入振蕩培養2d的待測菌液，每孔50μL，28℃恒溫培養，待對照西瓜枯萎病菌長至2/3時，測量菌落半徑并計算抑制率[19]。抑菌譜測定：選擇抑菌活性較強的菌株，采用與初篩相同的方法測定其對馬鈴薯晚疫病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌和玉米莖基腐病菌的抑菌活性。

1.2.3 拮抗菌株的生防特性

1)幾丁質酶活性檢測。取培養2d后的拮抗菌發酵液10μL，接種至幾丁質酶檢測平板上，28℃培養3d后觀察拮抗菌菌落周圍有無透明圈。

2)蛋白酶活性檢測。用牙簽挑取培養好的拮抗菌接種至蛋白酶檢測平板中央，28℃培養3d后，觀察菌落周圍有無透明圈。

3)纖維素酶活性檢測。將拮抗菌株接種到纖維素酶活性檢測平板上，28℃恒溫培養3d，向培養皿中加入1mg/mL的剛果紅溶液至平板表面完全被浸沒，靜置30min，棄染液，用1mol/L的NaCl溶液洗滌，觀察菌落周圍有無透明圈。

4)嗜鐵素檢測。將待測菌株接種到嗜鐵素檢測培養基上，28℃培養3d，觀察是否出現黃色暈圈。

1.3 盆栽防效測定

選擇健康飽滿的西瓜種子催芽后挑選出芽一致的西瓜種子分別播種至裝有無菌基質土的育苗盆中，于溫室中((28±2)℃，光照時間∶黑暗時間=16h∶8h)培養。待西瓜苗長出3片真葉時，將其移栽至裝有病土的盆缽中。試驗設置5個處理：①YZU-S7+FON；②YZU-S146+FON；③YZU-S149+FON；④百菌清500倍稀釋液+FON；⑤NB+FON。

西瓜枯萎病菌分生孢子懸浮液的制備：挑取西瓜枯萎病菌的菌餅接種至PDB培養基中，28℃、130r/min培養5d，采用血球計數板測定其孢子濃度。接種時將分生孢子懸浮液與無菌基質土混合均勻制成病土(1×105cfu/g)。

細菌懸浮液的制備：活化菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146后，將其分別接種至NB培養基中，28℃、130r/min培養48h，制成濃度為1×108cfu/mL的菌懸液。

移栽西瓜苗后采用灌根法接種細菌懸浮液，每株5mL。每隔5d進行1次試驗處理，共處理3次。以接種等體積NB培養基為對照，每處理10株西瓜苗，3次重復。在最后一次接菌后第18天調查各處理西瓜苗的發病情況，計算其病情指數和防效[20]。

1.4 拮抗菌株的形態學及分子鑒定

將篩選出來的具有拮抗作用的菌株接種到NA培養基上，觀察并記錄其菌落的形態、邊緣、顏色、大小及光澤等。使用OMEGA細菌基因組提取試劑盒提取YZU-S149 DNA，并采用16S rDNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R: (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′) 進行PCR擴增。反應體系(40μL)：PCR StarMix 20μL、正引物1.0μL、反引物1.0μL、DNA模板 2.0μL和ddH2O 16μL。擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性40s、58℃退火40s、72℃延伸60s，共30個循環；72℃再延伸10min。取少量PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至擎科新業生物技術有限公司測序。將測序結果在GenBank數據庫中比對分析，采用MEGA 7軟件構建系統發育樹。

1.5 數據處理

試驗所得數據采用SPSS 20.0軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和初篩

從對節白蠟幼根及根際中共分離出細菌303株，對西瓜枯萎病菌表現出拮抗作用的菌株共有50株，其中拮抗帶寬大于5mm的有14株，大多為內生菌(見表1)。

表1 西瓜枯萎病拮抗細菌的分離與初篩

2.2 拮抗菌株的復篩

西瓜枯萎病拮抗細菌的復篩結果表明，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146對西瓜枯萎病菌的拮抗效果較好，抑菌率分別為68.90%、73.51%和75.34%(見表2和圖1)。

表2 西瓜枯萎病拮抗菌株的復篩

圖1 拮抗細菌對西瓜枯萎病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of antagonistic bacteria on watermelon Fusarium wilt

2.3 拮抗菌株的抑菌譜及生防特性測定

抑菌譜測定結果表明，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米莖基腐病菌和馬鈴薯晚疫病菌均有較強的拮抗作用(見表3和圖2)。生防特性的測定結果顯示，這3株菌株均能產生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素，但不產生幾丁質酶。

表3 拮抗菌株的抑菌譜測定

2.4 拮抗菌株對西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽試驗結果表明，在最后一次接菌后18d后，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146對西瓜枯萎病的防效分別為51.76%、75.87%和65.48%，其中菌株YZU-S149的防效最好，且菌株YZU-S149和YZU-S146的防效均高于對照藥劑百菌清(見表4)。

表4 3株拮抗菌株對西瓜枯萎病的盆栽防效(接菌后18d)

2.5 生防菌株的鑒定

菌株YZU-S149的菌落扁平，正面呈灰白色，反面呈黃色，表面無光澤，略微干燥，邊緣不規則，菌落正中間較平坦，四周有明顯的皺褶隆起。16S rDNA序列分析表明，菌株YZU-S149的序列與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)IAM12118的序列相似度為100%。系統發育樹顯示，菌株YZU-S149與枯草芽孢桿菌處在同一分支上(見圖3)，初步鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

注：A為水稻紋枯病菌；B為小麥赤霉病菌；C為玉米莖基腐病菌; D為馬鈴薯晚疫病菌。圖2 菌株對4種病原菌菌絲生長的抑制作用Fig. 2 The inhibition effect of strains on mycelial growth of four pathogenic fungi

圖3 基于YZU-S149的16S rDNA序列及其相似序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of YZU-S149 and its homologous sequences

3 結論與討論

西瓜枯萎病是西瓜生產中最嚴重、影響最廣泛的病害之一，是制約西瓜生產的的一種世界性土傳真菌病害[21]。因此，對西瓜枯萎病的防治十分重要，生產上亟需解決的問題就是探索安全有效的防治方法。生物防治是利用微生物及其代謝產物防治植物病害，在保證經濟效益的同時，環境污染也較小，具有很好的應用前景[22]。為了獲得對西瓜枯萎病菌具有良好抑制作用的的生防細菌，本研究從對節白蠟的根部及根際篩選出3株對西瓜枯萎病菌具有顯著抑制活性的內生菌株，具有廣譜抑菌作用，表明其能產生抑菌活性較強的活性代謝產物，然而其產生的拮抗物質成分尚不明確，還需要進一步進行研究。

該研究篩選的3株細菌均能產生纖維素酶、蛋白酶和嗜鐵素，生防菌株可通過產生胞外酶降解病原菌的細胞壁，從而發揮生防作用[23]。鐵元素是大多數微生物生存所必需的成分，因此，生防菌通過產生嗜鐵素，大量吸收環境中的鐵離子，最終導致病原菌因缺鐵而失去致病能力[24]。芽孢桿菌是一類重要的生防菌株，已得到廣泛開發和應用[25]。該研究選擇對西瓜枯萎病盆栽防效最好的菌株YZU-S149進行鑒定，通過形態特征以及16S rDNA序列分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌。目前用于西瓜枯萎病的生防細菌主要是芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)[26]。李丹等[10]篩選的2株解淀粉芽胞桿菌不僅對西瓜枯萎病菌具有良好的抑菌活性，還能夠分解土壤中不能直接被植物吸收的物質，將其轉化為植物可吸收的營養，從而促進植物生長。馬利平等[27]分離的芽孢桿菌B96-Ⅱ不僅對西瓜枯萎病有較好的防效，對其他枯萎病有良好的防效。孫正祥等[28]分離的枯草芽孢桿菌XG-1具有促生作用，且有效定殖于西瓜根際與植株體內。該研究的菌株YZU-S149對西瓜枯萎病的室內盆栽防效為75.87%，優于百菌清500倍稀釋液的施用效果，具有良好的開發與應用前景。

該研究從對節白蠟中分離和篩選了西瓜枯萎病的生防菌株，并測定了拮抗菌株的盆栽防效，下一步將繼續測定其田間防效，以期為西瓜枯萎病的微生態制劑開發提供科學依據，實現藥肥雙減目標。