空間貼壁細胞培養模塊研制及特性測試

郭飛馬 3李 明 3王小雪 3李 飛

(1.中國空間技術研究院航天神舟生物科技集團有限公司，北京 100080；2.中國航天科技集團有限公司空間生物工程研究中心，北京 100080；3.北京市空間生物工程技術研究中心，北京 100080)

1 引言

隨著中國航天技術的不斷發展以及載人航天、深空探測等一系列空間探索任務的成功實施，特別是空間站的落成進入倒計時，為空間生命科學的飛速發展提供了良機。空間細胞生物學研究是空間生命科學的重要分支，研究空間環境下細胞的生物學過程及變化規律，對于探索空間特殊環境對人體系統的影響具有重要意義，并可為利用空間環境進行生物醫藥創新提供理論基礎與技術手段。

由于空間環境的特殊性，常規的地面細胞培養設備不能滿足在空間飛行條件下開展細胞實驗的需求，因此，需要研制特殊的、適合空間使用的細胞培養裝置。

目前國際空間站中的細胞培養系統主要有BioServe、GAP-FPA、Kubik和Bioculture等細胞培養系統。BCA(BioServe Culture Apparatus)主要用于懸浮細胞培養，它實現了自動氣體交換、定時取樣、手動換液和固定功能。TGAP-FPA(The Group Activation Pack-Fluid Processing Apparatus)在國際空間站中用于抗生素生產和細胞培養，由外殼、玻璃管、橡膠塞組成，利用橡膠塞的推進實現空間液體混合。Kubik在空間站中主要用于免疫細胞、淋巴細胞的培養和干細胞分化，在空間實現溫控和樣品冷凍。Bioculture是自動化的、在軌可操控的細胞培養實驗系統。該系統采用獨立灌注和計算機控制液體流速體系的組合技術，完成多種細胞培養基輸送及維持，并實現了溫度控制和氣體交換。

近年來，中國科研人員在細胞空間搭載方面取得了一些研究成果:王紅暉等通過神舟六號搭載心肌細胞和原代成骨細胞，實現了小載荷、多細胞搭載；劉紅菊等通過神舟十號搭載小鼠成肌細胞，證實空間飛行期間骨骼肌成肌細胞增殖分化的可塑性顯著降低；陳鈺等研制的空間微流控芯片生物培養和分析載荷由天舟一號貨運飛船送入太空，用于研究空間微重力環境下神經細胞與免疫細胞的相互作用。

本文研制一種適合在空間進行細胞培養的實驗模塊，并開展地面實驗進行性能測試。

2 模塊研制

空間細胞培養模塊的設計需要考慮以下幾個方面:①在空間微重力條件下，氣體和液體不會自然分離，培養容器中的氣體將會以氣泡的形式長期存在于培養液中，并對細胞的生長及活性產生嚴重影響。因此，在空間開展細胞培養實驗，必需使用密閉的培養容器，并且在其中充滿培養液，不能留存空氣。在這種情況下，如何在細胞培養過程中，維持培養液中氧氣和二氧化碳含量的穩定是一個關鍵問題。②在太空艙內各種資源都非常有限，因此，在模塊設計上需采用小型化、集成化設計，盡可能降低模塊的重量、體積、功耗及對其他資源的需求。③為便于在軌使用，空間細胞培養模塊除了需滿足空間飛行對安全性、可靠性等要求外，還需盡量采用簡單可靠的培養方法和自動化、模塊化設計，減少對航天員操作的需求，并保證實驗結果的可靠性。

空間細胞培養模塊要求培養面積大、培養液體積小、密封性好，并能濕熱滅菌。本模塊采用無源設計，最大外形尺寸為130 mm×90 mm×14 mm。整體由蓋板、疏水透氣膜、主體框架、O圈、緊固件、直通魯爾接頭等部分組成(圖1)。用兩側緊固件和密封O圈對培養室進行密封，組裝后即可進行貼壁細胞培養(圖2)。其中疏水透氣膜為透明薄膜，方便進行內外氣體交換，并可進行細胞形態觀察。

圖1 空間細胞培養模塊設計圖Fig.1 Design chart of space cell culture device

圖2 細胞培養模塊實物圖Fig.2 Physical picture of cell culture device

2.1 培養室設計

主體框架由聚碳酸酯(PC)制成，內部中空尺寸為80 mm×50 mm×8 mm，主體框架兩側具有凹槽可放置O圈，結合疏水透氣膜形成內部細胞培養室，容積約為30 mL。培養室單側培養表面積約為40 cm，可以進行雙側細胞培養，顯著增加單位面積的細胞培養量。當細胞在疏水透氣膜上貼壁培養時，可與外界進行氣體交換。疏水透氣膜具有較好的生物相容性，可以耐受濕熱滅菌條件，并可重復使用。

2.2 密封設計

培養室采用O圈密封，結合蓋板與緊固件加強密封效果與強度。O圈由醫用硅膠制成，具有良好的生物相容性，能耐受120℃(20 min)的滅菌條件，且密封效果好。蓋板由鋁合金制成，內側中空透氣。為實現培養液注入與交換，培養室通過主體框架內部管路與直通魯爾接頭連接，魯爾接頭即插即用，具有很好的密封效果。

3 性能測試

3.1 材料

骨肉瘤細胞(Human Osteosarcoma Cells，MG63)購買于美國模式培養物集存中心ATCC；DMEM培養基(Gibco，cat.11995-065)；10%胎牛血清(Hyclone)；CCK8試劑盒(日本同仁CK04)；Caspase-3分光光度法檢測試劑盒(凱基KGA202-KGA204)。

3.2 細胞培養和細胞活性檢測

MG63細胞調整細胞濃度為4×10個/mL，接種于6孔板中，2 mL/孔，即8×10個/孔。培養過夜待細胞貼壁后，換用10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)的培養基培養24 h，再加入高壓滅菌后的不同材料與MG63細胞共培養，同時設立陰性對照組。作用72 h、144 h后除去培養液和材料，用Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline，DPBS)清洗細胞，加入200μL含10%的CCK-8的無血清培養基，37℃溫浴1 h左右，取200μL上清于96孔板中，使用酶標儀450 nm波長檢測上清液OD值。

3.3 細胞裂解和總蛋白濃度測定

細胞培養方法同上，作用6 h、24 h、48 h、72 h、144 h后除去培養液和材料，用DPBS洗滌細胞2次，胰酶消化后，2000 rpm離心5 min，收集細胞，盡量去除DPBS上清，在收集的沉淀細胞中加入200μL預冷的Lysis Buffer，冰上裂解60 min，期間每20 min渦旋振蕩1次，每次10 s，裂解結束后在4℃下10 000 rpm離心1 min，吸取上清液轉移到新管中，并于冰上放置。

BCA試劑A與BCA試劑B按50∶1的比例配制成工作液，用移液管反復吹打，充分混勻。將標準品0，1，2，4，8，12，16，20μL加入96孔板的標準孔中，所有標準孔用標準品稀釋液補足到20μL。樣品孔加入2μL樣品后，用標準品稀釋液補足至20μL。每孔加入200μL BCA工作液，37℃孵育30 min。利用562 nm的波長檢測OD值，根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。

3.4 Caspase-3活性檢測

吸取50μL含100μg蛋白的細胞或組織裂解上清，體積不足50μL用10 mmol/L PBS補足至總體積50μL(各組均采用同樣的蛋白定量進行測定和比較)，加入50μL的2×Reaction Buffer，再加入5μL Caspase-3底物，并于37℃避光孵育4 h，用酶標儀在波長405 nm測定其吸光值。

3.5 裝置細胞培養和總蛋白測定

MG63細胞調整細胞濃度為1×10個/mL，將1 mL細胞液與15 mL新鮮培養基混勻，從培養室邊框的管路中接種于細胞培養裝置一側的透氣膜上，靜置4 h。再將另外1 mL細胞液與15 mL新鮮培養基混勻，從培養室邊框的管路中接種于細胞培養模塊另一側的透氣膜上，并使培養液充滿整個培養裝置。設立細胞培養瓶組作為陰性對照。靜置培養3天后，從培養室邊框的管路中吸取培養基，并用DPBS洗滌細胞2次，胰酶消化后，2000 rpm離心5 min，收集細胞，盡量去除DPBS上清，在收集的沉淀細胞中加入200μL預冷的Lysis Buffer，冰上靜置60 min，在靜置過程中渦旋振蕩3次，每次10 s，靜置結束后4℃10 000 rpm離心1 min，吸取上清液轉移至新的管中，放置在冰上待用。

蛋白裂解方法同上，根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。利用3.2和3.4的方法測定模塊內的細胞活性和Caspase-3活性。

3.6 統計分析

利用SPSS22.0軟件對數據進行統計，進行

t

檢驗和方差分析，

P

＜0.05認為差異具有統計學意義。

4 結果

4.1 材料對細胞活性的影響

在組裝模塊前所有與細胞接觸的材料都應進行生物相容性檢測。測試的材料包括主體框架材料、公魯爾接頭、母魯爾接頭和O圈。其中O圈選擇常用的硅膠、氟膠、丁晴3種材料。這些材料通過高壓滅菌與MG63細胞共培養72 h后，利用CCK8試劑盒檢測細胞活性，結果如圖3、圖4所示。結果可見，硅膠O圈與細胞共培養72 h和144 h后，對細胞活力的影響與對照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。而丁腈和氟膠材料的O圈與細胞共培養72 h和144 h后，與對照組相比顯著降低細胞活力，抑制細胞生長(

P

＜0.01，

P

＜0.05)。魯爾接頭和主體框架材料(PC)與細胞共培養72 h和144 h后，對細胞活力的影響與對照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。因此組裝模塊選用了硅膠材料的O圈。

圖3 O圈材料對細胞活力的影響Fig.3 Effects of O ring materials on cell viability

圖4 魯爾接頭和主體框架材料對細胞活力的影響Fig.4 Influence of Luer junction and main frame materials on cell viability

4.2 材料對細胞凋亡的影響

在組裝模塊前所有與細胞接觸的材料進行生物相容性檢查除細胞活力檢測外，還應檢測細胞凋亡，以期進一步觀察材料對細胞生長情況的影響。測試的材料包括主體框架材料、公魯爾接頭、母魯爾接頭和O圈。這些材料通過高壓滅菌與MG63細胞共培養6 h、24 h、48 h、72 h、144 h后檢測Caspase-3活性。Caspase家族與真核細胞的凋亡密切相關，其中Caspase-3是其中最重要的分子之一。它是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞正常生長過程中，它以酶原形式存在于胞漿中，無表達活性。在細胞發生程序性死亡的早期，caspase-3分子被激活，裂解相應的底物。因此Caspase-3的活性可以作為判斷細胞凋亡的指標。

結果如圖5、圖6所示。結果可見，硅膠O圈6 h、24 h、48 h、72 h、144 h共培養對細胞凋亡的影響與對照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。魯爾接頭和主體框架材料(PC)在6 h、24 h、48 h、72 h、144 h共培養后對細胞凋亡的影響與對照組相比，無顯著性差異(

P

＞0.05)。說明組裝模塊選用了所有材料與細胞生物相容性好，可以用于后續組裝。

圖5 魯爾接頭對細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of Luer junction on apoptosis

圖6 硅膠O圈和主體框架材料對細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of silicone O ring and host frame materials on apoptosis

4.3 培養模塊細胞測試

在組裝模塊前，所有與細胞接觸的材料進行生物相容性測試后，選擇適合的材料進行整機的適應性測試。采用T25細胞培養瓶和自主設計的空間細胞培養模塊培養MG63細胞72 h，觀察細胞形態。結果顯示細胞培養瓶和空間細胞培養模塊培養細胞的生長狀態一致，細胞鋪展狀態良好，如圖7、圖8所示。

圖7 細胞培養瓶中細胞形態Fig.7 Cell morphology in cell culture flask

圖8 空間培養模塊中的細胞形態Fig.8 Cell morphology in a space culture device

采用蛋白定量測定培養72 h后，1個空間培養模塊的細胞總蛋白量為5.7 mg，實驗結果顯示空間細胞培養模塊培養MG63細胞的總蛋白量相當于4個T25的細胞培養瓶收集的蛋白總量。這一結果有利于在空間環境中在同樣體積的培養模塊中獲得更大量的細胞樣品。

采用CCK8檢測試劑盒檢測MG63細胞在不同培養模塊培養72 h后的細胞活性，實驗結果顯示如圖9所示，表明自主設計的空間細胞培養模塊培養的細胞活性與細胞培養瓶中培養細胞活性無顯著性差異(

P

＞0.05)。

圖9 不同培養裝置對細胞活力的影響Fig.9 Effects of different culture devices on cell viability

檢測MG63細胞在不同培養模塊培養72 h后的Caspase-3活性，實驗結果如圖10所示，結果表明空間細胞培養模塊培養的細胞凋亡與細胞培養瓶中培養細胞無顯著性差異(

P

＞0.05)。細胞活力和凋亡的結果同時說明空間細胞培養模塊在短期的細胞培養中可以替代細胞培養瓶進行空間環境的細胞培養。

圖10 不同培養裝置對細胞凋亡的影響Fig.10 Effects of different culture devices on apoptosis

5 結論

本文設計了一種空間細胞培養模塊，該模塊操作簡單，密封效果好，生物相容性佳。培養膜疏水透氣便于細胞生長和觀察。利用此模塊培養MG63細胞72 h后，觀察細胞生長狀態和鋪展性良好，細胞活性和凋亡與傳統細胞培養瓶相比無顯著性差異。該模塊為空間體外培養細胞提供了便利的工具，可應用于空間飛行和空間站的細胞培養研究。