大黃素對(duì)肺炎鏈球菌肺炎大鼠氧化應(yīng)激損傷及miR-34a/SIRT1軸的影響

張小紅，王紅民，李楊，胡朝陽(yáng)，李鳳芝，常瑞，黃晗，靳莉

肺炎鏈球菌是一種球狀革蘭陽(yáng)性菌，是引發(fā)兒童呼吸道感染致肺炎的最常見(jiàn)病原菌，全球每年至少有100萬(wàn)5歲以下兒童死于肺炎鏈球菌肺炎，尤其在發(fā)展中國(guó)家其危害更加嚴(yán)重［1-2］。抗生素雖可有效治療肺炎鏈球菌肺炎，但研究顯示，目前46.1%的侵襲性肺炎鏈球菌臨床分離株存在多藥耐藥，因此積極尋找新型替代治療藥物具有重要臨床意義［3］。大黃素是傳統(tǒng)中藥大黃的主要有效單體成分，藥理學(xué)作用廣泛，具有抗氧化、抗炎、調(diào)脂、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種功效［4-6］。研究報(bào)道，大黃素可通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)等途徑發(fā)揮對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠的保護(hù)作用［7］。但是，目前關(guān)于其對(duì)肺炎鏈球菌性肺炎氧化應(yīng)激損傷的作用及機(jī)制尚不完全明確。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類(lèi)可降解和抑制靶基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的非編碼小RNA，其中miR-34a與多種細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，可通過(guò)靶向抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）在神經(jīng)細(xì)胞［8］、人晶狀體上皮細(xì)胞［9］及內(nèi)皮細(xì)胞［10］等氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用。本研究擬探究大黃素對(duì)肺炎鏈球菌肺炎大鼠模型氧化應(yīng)激損傷及miR-34a/SIRT1軸的影響，以揭示其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。大鼠在溫度（22±2）℃、濕度60%～65%、光照/黑暗12 h/12 h環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水、采食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，批號(hào)ATCC49619，購(gòu)自上海碩欣生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)前1 d接種于血瓊脂平皿上，置于37℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用時(shí)以無(wú)菌生理鹽水調(diào)整為1.0×107CFU/mL（CFU：菌落形成單位）。

1.1.3 試劑 大黃素（批號(hào)：E7881）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑（批號(hào)：R0016）購(gòu)自上海碧云天公司；miRNA實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒（批號(hào)：20180114）、PrimeScriptTMRT reagent Kit（批 號(hào)：20170211）、TB Green?Premix Ex TaqTMII（批號(hào)：20180120）均購(gòu)自TaKaRa生物公司；大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（貨號(hào)：ab236712）、白細(xì)胞介素（IL）-6 ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab234570）、兔源一抗anti-SIRT1（批號(hào)：20190111）、anti-GAPDH（批號(hào)：20180225）、羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：20180621）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC0170、BC0020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）ELISA檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：ml027901）購(gòu)自酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備 參照文獻(xiàn)［11］，采用氣管滴加肺炎鏈球菌法制備肺炎模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉全身麻醉后仰臥固定放置于37℃保溫墊的手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒后，縱向切開(kāi)頸部皮膚，暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)入針注射肺炎鏈球菌混懸液0.4 mL（1.0×107CFU/mL），第5天重復(fù)注射1次，第8天成功建立肺炎鏈球菌肺炎大鼠模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分假手術(shù)組、模型組、低劑量大黃素組、中劑量大黃素組、高劑量大黃素組，每組12只。假手術(shù)組除不注射肺炎鏈球菌混懸液外其他操作與模型制備相同。建模成功后24 h，低、中、高劑量大黃素組分別腹腔注射20、40、80 mg/kg大黃素溶液，每日1次，連續(xù)7 d；假手術(shù)組、模型組同時(shí)注射等量生理鹽水。

1.2.3 標(biāo)本采集 末次給藥后24 h，各組大鼠常規(guī)麻醉后處死，開(kāi)胸取雙肺組織，部分置于液氮中保存?zhèn)溆茫糠植捎?%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水后，石蠟包埋，制作0.5μm厚度切片，保存?zhèn)溆茫涣砣〔糠址谓M織制備10%勻漿液，3 500 r/min離心15 min后收集上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HE染色觀(guān)察肺組織病理變化 肺組織切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色、分化液處理、返藍(lán)液返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、風(fēng)干、封片等步驟后，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各組大鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.2.5 肺組織炎癥因子水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿上清液中TNF-α、IL-6水平，具體檢測(cè)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 采用可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)肺組織勻漿上清液中SOD、MDA水平，ELISA檢測(cè)GSH-Px水平。

1.2.7 qPCR檢測(cè)肺組織miR-34a、SIRT1 mRNA表達(dá) Trizol法提取肺組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度，樣品合格（OD260/280為1.7～2.2）后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎胵PCR法檢測(cè)miR-34a、SIRT1 mRNA表達(dá)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA（50 mg/L）2μL，上、下游引物（10μmol）各0.8μL，ddH2O 6.0μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，61℃31 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)肺組織miR-34a、SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

Tab.1 The primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.8 Western blot檢測(cè)肺組織SIRT1蛋白表達(dá) 蛋白抽提試劑盒提取肺組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，加一抗anti-SIRT1（1∶2 000）、anti-GAPDH（1∶500），4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜后，添加二抗IgG（1∶5 000），37℃孵育1 h，洗膜，顯色，曝片，觀(guān)察并分析各蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），組間多重比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理改變 假手術(shù)組大鼠肺組織正常，無(wú)明顯病理改變；模型組大鼠肺泡塌陷，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；低、中、高劑量大黃素組肺組織炎性病變均減輕，其中高劑量大黃素組減輕效果最明顯。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平顯著增高（P＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量大黃素組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05），高劑量大黃素組降低最明顯，見(jiàn)表2。

Fig.1 Histopathological changes of lung tissues in five groups(HE staining,×400)圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

Tab.2 Comparison of TNF-αand IL-6 levels in lung tissues between five groups表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平比較（n=12，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of TNF-αand IL-6 levels in lung tissues between five groups表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平比較（n=12，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與低劑量組大黃素組比較，d與中劑量大黃素組比較，P＜0.05

?

2.3 各組大鼠肺組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織SOD、GSH-Px水平顯著降低，MDA水平顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量大黃素組大鼠肺組織中SOD、GSH-Px水平顯著增加，MDA水平顯著降低（P＜0.05），高劑量大黃素組改善最明顯，見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠肺組織miR-34a、SIRT1 mRNA水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織miR-34a水平顯著增高，SIRT1 mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量大黃素組大鼠肺組織miR-34a水平顯著降低，SIRT1 mRNA水平顯著增高（P＜0.05），高劑量大黃素組變化最明顯，見(jiàn)表4。

Tab.3 Comparison of SOD,MDA and GSH-Px levels in lung tissues between five groups表3各組大鼠肺組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較（n=12，±s）

Tab.3 Comparison of SOD,MDA and GSH-Px levels in lung tissues between five groups表3各組大鼠肺組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較（n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與低劑量組大黃素組比較，d與中劑量大黃素組比較，P＜0.05

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Tab.4 Comparison of miR-34a,SIRT1 mRNA and protein levels in lung tissues between five groups表4各組大鼠肺組織miR-34a、SIRT1 mRNA及蛋白水平比較 （n=12，±s）

Tab.4 Comparison of miR-34a,SIRT1 mRNA and protein levels in lung tissues between five groups表4各組大鼠肺組織miR-34a、SIRT1 mRNA及蛋白水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與低劑量組大黃素組比較，d與中劑量大黃素組比較，P＜0.05

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2.5 各組大鼠肺組織SIRT1蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織SIRT1蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量大黃素組大鼠肺組織SIRT1蛋白水平顯著增高（P＜0.05），高劑量大黃素組增高最明顯，見(jiàn)表4、圖2。

Fig.2 Protein expressions of SIRT1 in lung tissues of five groups of rats圖2 各組大鼠肺組織SIRT1蛋白表達(dá)情況

3 討論

本研究首先采用氣管滴加肺炎鏈球菌感染法制備肺炎大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠肺泡塌陷，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺組織TNF-α、IL-6水平顯著增加，TNF-α、IL-6均為促炎因子，機(jī)體感染肺炎鏈球菌后，巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生大量TNF-α、IL-6，共同促進(jìn)肺組織炎癥進(jìn)展，提示模型制備成功，可用于后續(xù)研究。大黃素別名朱砂蓮甲素，化學(xué)式C15H1005，是從大黃根莖中提取的主要有效單體活性成分。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，大黃素具有廣譜抗微生物、抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種藥理學(xué)作用［12-13］。Zhong等［14］研究報(bào)道，大黃素可抑制腸道病毒71復(fù)制和調(diào)節(jié)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的細(xì)胞周期分布。謝璟等［15］發(fā)現(xiàn)大黃素可降低肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織TNF-α、IL-6水平，減輕炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制p38 MAPK mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中、高劑量大黃素可顯著減輕肺炎大鼠肺組織炎癥反應(yīng)及TNF-α、IL-6水平，其中高劑量大黃素組效果最優(yōu)，提示大黃素可能對(duì)肺炎鏈球菌性肺炎有一定治療作用。

本研究結(jié)果亦顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織SOD、GSH-Px水平顯著降低，MDA水平顯著增高。正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)氧自由基及活性氧的生成及清除處于動(dòng)態(tài)平衡，炎癥、病原微生物感染、缺血/再灌注等均可導(dǎo)致機(jī)體活性氧生成遠(yuǎn)大于機(jī)體清除能力，引起組織或細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［16］。MDA是膜脂過(guò)氧化重要產(chǎn)物之一，可加劇膜損傷，SOD、GSH-Px均是體內(nèi)重要抗氧化物金屬酶，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起重要作用；而大黃素可顯著提高肺炎大鼠肺組織SOD、GSH-Px活性，降低MDA水平，提示大黃素可抗肺炎鏈球菌感染引起的肺組織氧化應(yīng)激損傷。miR-34a是一種與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的miRNA，SIRT1是一種去乙酰化酶，可調(diào)控細(xì)胞增殖、代謝，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種功能。多項(xiàng)研究表明，miR-34a與SIRT1存在直接靶向調(diào)控關(guān)系，抑制miR-34a表達(dá)，可激活SIRT1表達(dá)，有效抑制血管、糖尿病性血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝組織等氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)［17-19］。Zhang等［20］研究報(bào)道，大黃素可保護(hù)心肌細(xì)胞H9c2免受缺氧損傷，可能與上調(diào)miR-138表達(dá)，激活SIRT1/AKT和Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織miR-34a表達(dá)水平顯著增加，SIRT1 mRNA及蛋白水平顯著降低，而大黃素可顯著降低模型大鼠肺組織miR-34a表達(dá)水平，增加SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)，提示大黃素減輕肺炎鏈球菌肺炎大鼠氧化應(yīng)激損傷可能與抑制miR-34a表達(dá)，促進(jìn)SIRT1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控miR-34a/SIRT1軸有關(guān)。

綜上所述，大黃素可減輕肺炎鏈球菌大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，可能與調(diào)控miR-34a/SIRT1軸有關(guān)。但關(guān)于miR-34a與SIRT1在肺炎大鼠中具體調(diào)控關(guān)系及大黃素對(duì)該信號(hào)軸的直接還是間接調(diào)控作用尚未知，有待后續(xù)深入研究。