基于LC-MS代謝組學的紅桿與綠桿型多花黃精化學成分比較研究

姜 武，翁國杭，陳家棟，葉傳盛，姜鑫凱，陶正明

（1浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005；2浙江烏巖嶺國家級自然保護區管理中心，浙江溫州 325500；3麗水億康生物科技有限公司，浙江麗水 323800；4溫州醫科大學，浙江溫州 325035）

0 引言

多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)為百合科黃精屬多年生草本植物，其干燥根莖為《中國藥典》2020年版收載品種之一，具有補氣養陰，健脾，潤肺，降脂和益腎的功效[1-2]。現代藥理研究表明，多花黃精含有多糖、皂苷類和黃酮類等主要有效成分，具有調節免疫，抗氧化、延緩衰老、抗疲勞、降血糖、調血脂、抗腫瘤、改善造血功能等多種藥理作用[3]。研究表明，不同產地多花黃精中多糖、黃酮和浸出物含量存在差異，地理環境、生長年限和采收季節是影響其化學成分含量的關鍵因素[4]。倪天宇等[5]采集了浙江地區不同生境下的多花黃精，分別測定多花黃精的折干率、浸出物、黃精多糖、總黃酮、總皂苷和總酚含量，結果發現不同生境下多花黃精折干率、浸出物、多糖及總皂苷含有量差異顯著；折干率與化學成分含有量均呈正相關。涂明峰等[6]對8個產地收集的多花黃精中多糖、黃酮、多酚、浸出物、Cu、Se、Pb、Cd的含量進行比較分析也發現不同產地的多花黃精化學成分含量存在一定的差異。多花黃精廣泛分布于長江流域及珠江流域，其中安徽、湖南、浙江等地產多花黃精品質較好可視為道地產區。不同產地因其生長環境不同，化學成分也存在一定的差異性，氣候、緯度、地理位置等多種因素都會對多花黃精的化學成分含量造成影響[7]。前人關于不同產地多花黃精化學成分差異性的研究較多[8-12]，但采用LC-MS代謝組學技術對不同產地多花黃精化學成分進行比較分析尚未見文獻報道。中藥材的化學成分是其藥效的物質基礎，因此，揭示不同種質多花黃精的化學成分差異是其質量評價的基礎。植物代謝組學可對植物提取物中代謝組進行無差別代謝成分全分析，對具體藥用部位及具體化學成分尚不清楚的中藥材尤其適用，該技術已成功應用于半楓荷根[13]、野菊花[14]、林下山參生長年限鑒定[15]等研究。該技術不僅可以反映不同樣品之間的相似性，還可確定不同樣本的差異性，為中藥質量控制提供了一種有別于指紋圖譜的整體性分析方法。

本課題組在浙江麗水慶元百山祖（紅桿）和溫州永嘉四海山（綠桿）中發現了兩種野生品種，通過多年的引種栽培發現在性狀及抗逆性方面紅桿型多花黃精均優于綠桿型，為豐富浙江產多花黃精種質資源庫及選育品質更加優良的多花黃精品種，本研究采用液相色譜-質譜聯用(LC-MS)技術的植物代謝組學方法對麗水慶元百山祖（紅桿）和溫州永嘉四海山（綠桿）多花黃精藥材的整體化學輪廓進行比較分析，通過主成分分析法進行比較研究，旨在研究不同種質浙產多花黃精化學成分差異，為后期的紅桿型多花黃精品質評價及栽培育種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器系統主要包括高效液相色譜和串聯質譜Thermo LC-MS(Ulimate 3000LC,Q Exactive)，色譜柱：Hyper gold C18(100×2.1×1.9 mm)；離心機(Heraeus Fresco 17,Thermo Fisher Scientific)；天平(BSA124SCW，Sartorius)；研磨儀（JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）；純水儀（明澈D24UV，Merck Millipore）；超聲儀（PS-60AL，深圳市雷德邦電子有限公司）。

甲醇（LC-MS級67-56-1），購自Merck(Darmstadt,Germany)；乙腈（LC-MS級 75-05-8），購自 Merck(Darmstadt,Germany)；甲酸（LC-MS級64-18-6），購自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)；超純水（LC-MS級7732-18-5），購自 Merck(Darmstadt,Germany)；L-2-氯苯丙氨酸（純度≥98%），購自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)。

1.2 試驗材料

紅桿和綠桿多花黃精分別于2019年10月底采自浙江麗水市慶元縣百山祖鄉(118°50'E,27°47'N)、溫州永嘉四海山(120°43'E,28°29'N)，其生長年限為第3年。樣品經浙江省亞熱帶作物研究所陶正明研究員鑒定為多花黃精。

1.3 農藝性狀檢測

于2019年10月初，每個種質隨機選取生長良好、長勢基本一致的100株不同種多花黃精定點定株標記。分別以直尺和游標卡尺測定株高、莖粗；以LI-3000C葉面積儀測定葉長、葉寬和葉面積；采集10片葉片采用疊加測定法測定葉厚；并采用潘德芳[16]的方法測定根莖多糖含量。在兩個種質樣地采集3個區域，每個區域至少10株重復，其中紅桿和綠桿多花黃精分別做3次生物學重復。

1.4 色譜條件

柱溫為40℃；流速300 μL/min；流動相組成A：水＋0.1%甲酸，B：乙腈＋0.1%甲酸；進樣量為4 μL，自動進樣器溫度4℃，其中液相色譜流動相反應條件見表1。

表1 液相色譜流動相條件

1.5 質譜條件

正模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 KV；毛細管溫度：350℃；S-Lens RF Level，30%。負模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細管溫度：350℃；S-Lens RF Level，60%。掃描模式：一級全掃描(Full Scan,m/z 70～1050)與數據依賴性二級質譜掃描(dd-MS2,TopN=10)；分辨率：70000（一級質譜），17500（二級質譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離(HCD)。

1.6 數據處理

使用Compound discoverer軟件（Thermo公司）對LC-MS檢測數據進行提取和預處理，整理成二維數據矩陣形式，包含保留時間(RT)、分子量(MW)、觀察量（樣本名稱）、峰強度等信息。對QC樣品的總離子流色譜圖(TIC)色譜圖進行重疊。多元分析采用SIMCAP 13.0軟件，對不同類型多花黃精差異化學成分進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法辨別分析(OPLS-DA)，采用Sigmaplot 10軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 紅桿與綠桿多花黃精農藝性狀及多糖成分含量比較分析

由表2可知，除株高、莖粗外，紅桿多花黃精葉厚、葉長、葉寬、葉面積等農藝性狀均顯著優于綠桿型多花黃精，說明多花黃精不同種源之間差異較大。麗水產紅桿多花黃精不僅葉厚、葉長、葉寬、葉面積農藝性狀優勢明顯，且田間觀察發現整齊性較高，生長比較穩定。

表2 不同多花黃精農藝性狀差異比較分析

黃精多糖是多花黃精最重要的藥用成分，據中國藥典標準規定，合格黃精藥材多糖含量不低于7%。由表3可以看出，兩地產多花黃精多糖含量均達到藥典規定的標準，其中紅桿型黃精多糖含量高達11%以上，說明兩產地多花黃精多糖含量差異較大。

表3 不同多花黃精種質多糖含量比較分析

2.2 紅桿與綠桿多花黃精化學成分輪廓分析

采用LC-MS對紅桿型與綠桿型多花黃精花樣本進行分析，發現不同類型多花黃精中的化學成分種類基本相同，含量卻有所差異。圖1為多花黃精根莖總離子流圖，由于多花黃精在正離子模式(ESI+)下離子化效果較好，QC樣品總離子流色譜圖穩定，導出的化合物靈敏度較高且樣品重現性較好，因此本研究采用正離子模式進行檢測分析。結合文獻[17-18]，依據LCMS矩陣中的得保留時間注釋來源、預測成分以及NIST11檢索匹配進行指認，共鑒定出22種主要化合物，結果見表4。

表4 多花黃精根莖化學成分LC-MS分析

圖1 QC樣本總離子流色譜圖(ESI+)

2.3 多花黃精樣品主成分分析

將采集的不同地點多花黃精藥材數據樣本導入SIMCA-P 11.0軟件，以樣本的峰面積相對百分含量為特征值，將數據標準化后進行PCA分析。PCA為無監督的分析方法，可以反映數據的原始狀態，同時反映組內和組間的差異；為了突出組間差異，便于后續尋找差異成分，采用有監督的正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)（圖2）對數據進行分析。麗水慶元百山祖（紅桿）和溫州永嘉四海山（綠桿）多花黃精樣本在主成分空間中的分布比較分散，浙江麗水與溫州由于地理位置和氣候條件的差異，不同地理特征種植區域樣本處于主成分空間分布位置也不同，多花黃精化學成分組成及比例也具有一定的特征性，結果見圖2。

圖2 紅桿與綠桿型多花化學輪廓的OPLS-D(左)和S-plot(右)得分(R2X=0.665,R2Y=0.997,Q2=0.982)

將2個產地的多花黃精藥材樣本數據標準化后進行PCA分析，所得到的載荷圖如圖3所示。從載荷圖上可以看出69個組分峰分布比較分散，得分圖中的G組與R組樣品點之間的分布有所散離，說明兩組樣品之間的代謝產物存在一定的差異，但沒有實現完全的分離，組內樣品之間的樣本點分布較為分散，R2和Q2是數據模型質量參數，R2＞0.5說明模型擬合效果好，且PCA得分圖中所有樣品均在95%置信區間。使用正離子模式數據生成的PCA模型的質量(R2=0.665,Q2=0.982)要優于負離子模式(R2=0.537,Q2=0.886)，樣品的聚類分離效果也較好，該結果表明不同產地的多花黃精化學成分在組分和含量上差異較大，PCA載荷圖分析結果與LC-MS分析結果相一致。

圖3 不同產地多花黃精樣品主成分分析載荷圖

為防止發生過度擬合常用置換檢驗模型的有效性，若Q2值大于左邊任意一個Y變量隨機排列模型的Q2值，在Y軸上的截距小于0可認為該模型質量較好，沒有發生過度擬合[19]。重復測試200次循環迭代置換檢驗結果圖見圖2，Q2的回歸直線與Y軸的交點在負半軸，正離子模式Q2Y(cum)(0,0.988)，Q2(cum)(0,-0.0853)，說明建立的OPLS-DA模型是穩定可靠的，不存在擬合現象。因此，可用來探究紅桿型和綠桿型多花黃精的化學成分及代謝物差異。

2.4 紅桿與綠桿多花黃精差異代謝物分析

以OPLS-DA模型的VIP得分(VIP＞1)，并結合t檢驗(t-test)的結果P值(P＜0.05)來尋找兩品種間的標志性差異代謝物。由表4可知，兩種多花黃精樣品中共篩選出22種代謝產物，其中篩選得到15種差異代謝物在紅桿多花黃精中的相對含量高于綠桿多花黃精，說明兩種多花黃精由于栽培地點及生態環境的差異，相同代謝產物的含量也有所差別，結果見表5。差異代謝物中，發現多種參與蛋白合成的氨基酸，如脯氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、谷氨酸存在顯著差異，氨基酸是構成生物體蛋白質的基礎物質之一，還具有滋補強身功效。另外，紅桿品系多花黃精的檸檬酸顯著高于綠桿，檸檬酸為一種抗氧化劑，有抑制細菌等作用。檸檬酸還具有螯合作用，能夠清除某些有害金屬。說明紅桿多花黃精可能具有更強的抗逆性。

表5 紅桿與綠桿多花黃精LC-MS分析差異代謝物的VIP值

3 討論

3.1 紅桿與綠桿型多花黃精農藝性狀差異研究

本研究中，多花黃精的株高、葉面積等農藝性狀及藥用有效成分根莖多糖在不同種源間均達到顯著或極顯著差異，說明多花黃精不同種源間蘊藏著豐富的遺傳變異，存在著較大的優良種源選擇潛力[20]。研究表明多花黃精的葉面積與株高均呈極顯著正相關，與根莖鮮質量呈顯著正相關，這說明可以利用葉面積對高產多花黃精進行優良種源做初步選擇；多花黃精根莖多糖含量與株高、莖粗均呈負相關，這意味著多花黃精生長的越快，其有效成分含量積累的越少[21-24]。筆者經過多年研究，成功的進行紅桿多花黃精的引種，通過兩地的種源比較分析，進一步表明紅桿多花黃精品質優良。

3.2 紅桿與綠桿型多花黃精差異化合物篩選分析

多花黃精野生資源主要分布在安徽、貴州、浙江、湖南、云南等地，近年來多花黃精人工栽培面積在浙江省逐年增加，而浙江不同產地多花黃精品質差異相關研究尚未見文獻報道[25-26]。本研究通過表型鑒定發現浙江麗水慶元百山祖生長多花黃精多為紅桿，而溫州永嘉四海山所產則為綠桿，為了探究兩地產多花黃精內在品質的差異，本研究利用LC-MS代謝組技術對兩地采集的樣本進行化學成分差異性分析。通過PCA主成分分析發現，兩地產多花黃精藥材中的化學物質成分種類和相對含量差異較大。紅桿與綠桿型多花黃精的代謝輪差異明顯，表明兩者在化學成分上存在明顯差異。12個多花黃精樣本中共鑒定出22個化合物，兩種質多花黃精化學成分的組分和代謝產物VIP值差異顯著。分析結果表明，檸檬酸、苯甲酸、甲氧基水楊酸、L-色氨酸、5-羥甲基糠醛、脯氨酸、丙酮酸、L-賴氨酸、組氨酸和γ-亞麻酸乙酯等10類差異代謝物含量在兩者間存在顯著差異。這些結果表明紅桿和綠桿型不僅在形態方面存在差異，其內在化學成分也不盡相同，紅桿品系相比較綠桿有更佳的營養品質。據文獻報道已知11月降水量、月降水量等環境因子是影響多花黃精分布的主導環境因子，而季節降水量變異系數和最暖季平均溫對多花黃精的分布影響最小，這說明決定多花黃精能否在當地生長的主要因素是春秋二季月降水量，夏季的氣候條件對多花黃精的影響較小[27-28]。盡管多花黃精的適宜栽培地區較為廣泛，但是不同產地的降水量、氣候以及土壤差異都會影響其內在品質。陳龍勝等對不同產地多花黃精揮發性物質研究表明湖北赤壁、湖北隨州、湖北恩施和湖南岳陽所產多花黃精揮發性成分較為一致，但安徽所產多花黃精和湖北地區相比，所含化學成分存在較大差異，其中栽培基質對多花黃精生長及有效成分積累也有較大影響[29-30]。

4 結論

本研究采集了浙江2個產地不同區域的2種不同表型多花黃精種質，通過農藝性狀比較研究顯示麗水產紅桿種質的葉厚、葉長、葉寬、葉面積和多糖含量等指標均顯著優于永嘉產綠桿多花黃精，說明不同產區多花黃精不同種間差異較大。代謝組結果顯示多花黃精樣本共鑒定出22個化合物，2種質多花黃精根莖的檸檬酸、L-色氨酸、脯氨酸、L-賴氨酸、組氨酸等10差異代謝物含量存在顯著差異，且以紅桿種質含量較高。隨著黃精人工栽培面積的快速增長，人們對黃精藥材的要求已經不僅僅局限于“量”，從滿足“健康中國”和“人民日益增長的美好生活需要”角度來看，黃精藥材的品質更應得到關注。本研究結果對浙江產多花黃精的生態適應性評價和新品種選育具有重大意義。