拮抗芽孢桿菌對蒙古黃芪主要藥效成分的影響

郭 捷，田海嬌，秦雪梅，趙曉霞，高 芬

（1山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，太原 030006；2山西大學中醫藥現代研究中心，太原 030006；3山西大學應用化學研究所，太原 030006）

0 引言

黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus var.mongholicus)或膜莢黃芪(Astagalus membranaceus)的干燥根，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效。在臨床上應用廣泛，具有免疫調節、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒等多種藥理作用[1]，其主要活性成分包括黃酮類化合物、皂苷類化合物、黃芪多糖等[2]。但是，隨著黃芪用量的急劇增長，多年生傳統黃芪（野生）遠遠不能滿足需求，并急劇減少，幾乎絕跡。隨著中藥現代化的發展，20世紀70—80年代育苗移栽2年生蒙古黃芪的栽培技術在甘肅、內蒙、山西等地獲得成功[3]。2012年黃芪納入藥食同源目錄，年需求量達3.5萬～4萬t，其中90%以上為移栽黃芪，且主要是蒙古黃芪[4]。山西作為蒙古黃芪的主產區，移栽芪的種植面積日趨擴大，但隨之而來被稱為“植物癌癥”的根腐病發生逐年加重[5-6]，給黃芪產業的發展造成了明顯影響。

同時，研究人員還發現移栽芪中某些藥效成分明顯低于（仿）野生芪。如杜國軍等[3]報道傳統黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和總多糖含量明顯高于2年生移栽黃芪；劉鳳波等[7]發現野生黃芪總皂苷的含量較栽培黃芪高；熊一峰等[8]比較了山西2種種植方式黃芪的次級代謝產物的差異后，發現傳統芪中黃芪皂苷Ⅲ的含量顯著高于移栽芪，移栽芪中的黃芪皂苷Ⅰ顯著高于傳統芪，但4種皂苷含量的總和無顯著差異；Li等[9]發現野生黃芪中多糖和糖綴合物等糖類組分的含量普遍高于速生黃芪。藥材中的化學成分是其發揮藥效的物質基礎，藥效成分的穩定性和均一性是確保中藥材質量及中醫臨床用藥安全有效的關鍵[10]。因此，移栽芪藥效成分含量變化導致的藥材質量不穩定及質量下降問題也成為了困擾黃芪栽培發展的瓶頸。

利用有益拮抗微生物進行病害生物防治是目前的研究熱點，其中芽孢桿菌以抗逆性強、易于在植物根際定殖、對病原菌具有拮抗作用等優勢，對多種作物的土傳病害顯示出了良好的防治效果[11-13]，同時還可促進植物生長，提高產量[14-15]。不僅如此，芽孢桿菌在調節植物營養成分、改善品質方面也顯示出了潛力。如吳東升[16]發現解淀粉芽孢桿菌T3可提高西瓜中可溶性糖的含量，改善其風味和品質。鞏子毓等[17]在設施黃瓜的種植中施用含解淀粉芽孢桿菌SQR9的生物有機肥，明顯提高了黃瓜中維生素C、可溶性糖、可溶性蛋白的含量。劉德興等[18]也發現多粘性芽孢桿菌生物菌肥處理在提高甜瓜單果重的同時，促進了可溶性糖和維生素C含量的升高。

芽孢桿菌對中藥材藥效成分也有影響。Karthikeyan等[19]報道，固氮菌、芽孢桿菌和假單胞菌等根際促生細菌共同作用可以提高長春花抗癌有效成分生物堿的含量。Sharaf-Eldin等[20]報道枯草芽孢桿菌FZB24可以提高藏紅花中番紅花苦苷、番紅花酸和藏紅花醛的含量。宋勝男等[21]研究發現內生多黏類芽孢桿菌對農田人參生長和皂苷累積起著促進作用。馮世鑫等[22]發現枯草芽孢桿菌肥施用后羅漢果中的主效成分皂苷Ⅴ含量明顯升高。目前，雖未見芽孢桿菌對蒙古黃芪有效成分影響的相關報道，但有研究發現，非生物誘導子水楊酸(SA)、萘乙酸(SNP)和硝普鈉(NAA)可分別有效提高其黃酮、皂苷及多糖的含量[23]。

鑒于黃芪作為藥用植物在生產和用途上的特殊性，在病害防治中使用的制劑既要能有效防治病害，又不能影響藥材的品質。菌株SXKF16-1(Bacillus atrophaeu)[24]和 SXKF16-2(B.methylotrophicus)是本課題組前期以根腐病致病菌腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)和銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)為靶標篩選獲得的2株拮抗芽孢桿菌，其發酵液對黃芪根腐病具有較好的預防和治療效果。但是，上述菌株的發酵液施用后對黃芪藥效成分的影響，以及能否提升某些藥效成分的含量等問題還不明確。本研究采用課題組前期建立的HPLC-UV-ELSD法，測定并分析上述2株拮抗芽孢桿菌發酵液施用后，蒙古黃芪10種主要藥效成分（黃酮類包括毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素；皂苷類包括黃芪皂苷IV、黃芪皂苷III、黃芪皂苷II和黃芪皂苷I）的含量變化，以明確其對黃芪藥效成分的影響，進而尋找藥效成分的促進因子，旨在為開發具有抗病增效作用的多功能制劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蒙古黃芪（以下簡稱黃芪）生長6個月的新鮮健康黃芪（根長15 cm左右，直徑3～4 mm），采自山西寧武黃芪種植基地。黃芪品種由山西大學中醫藥現代研究中心秦雪梅鑒定。

拮抗菌為菌株SXKF16-1(Bacillus atrophaeus)、菌株SXKF16-2(B.methylotrophicus)，由本課題組前期篩選獲得并保存。

1.2 儀器與試劑

Waters e2695液相色譜儀、Waters 2489紫外可見檢測器、Chromachem ELSD檢測器、Empower色譜工作站；RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Sartorius BSA124S分析天平。

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）。

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(CAS No.20633-67-4)、芒柄花素(CAS No.485-72-3)、黃芪皂苷 I(CAS No.84680-75-1)、黃芪皂苷 II(CAS No.84676-89-1)、黃芪皂苷III(CAS No.84687-42-3)、黃芪皂苷IV(CAS No.84687-43-4)、紫檀烷苷(CAS No.94367-42-7)和異黃烷苷(CAS No.94367-43-8)均購于上海永恒生物科技有限公司；芒柄花苷(CAS No.486-62-4)、毛蕊異黃酮(CAS No.20575-57-9)購于成都曼斯特公司；質量分數均大于98%。

1.3 試驗方法

1.3.1 拮抗菌發酵液的制備與澆注 分別將拮抗芽孢桿菌SXKF16-1、SXKF16-2在PDA培養基上活化48 h(28℃)，配制成濃度為1.5×107～2.0×108cfu/mL的菌懸液，按體積比4%的比例接種到50 mL（250 mL三角瓶）的專用發酵培養基中，搖床恒溫振蕩培養48 h(180 r/min，30℃)，用血球計數板計數拮抗菌數量后，用于黃芪苗的澆注。黃芪幼苗移栽40天后澆注拮抗菌發酵液；每盆300 mL，澆注3次，每次間隔10天；第3次澆注后20天采集樣本并置于液氮速凍15 min后，于-80℃冰箱保存備用。對照組黃芪澆注相同體積的水。花盆內徑17 cm、高15 cm，齊沿將土裝滿；每處理3次重復（3盆），每盆15株；從每重復中隨機采樣5株，共計15株進行測定。

1.3.2 供試品溶液的制備 將各處理黃芪樣品晾干，用研缽研磨后過篩；精確稱取黃芪粉末1.5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入60 mL甲醇加熱回流3 h后過濾；濾渣用20 mL甲醇沖洗3次，合并濾液，旋轉至干；用色譜純甲醇溶解試樣，超聲2～3 min使其充分溶解后，轉移至5 mL容量瓶中定容[3]；用0.22 μm有機相濾膜過濾，上機測定。

1.3.3 色譜條件 按照課題組前期已建立的方法[8]進行測定。流動相為乙腈(A)-水(B)，體積流量為1.0 mL/min；蒸發光檢測器參數N2壓力158.5 MPa，霧化溫度35℃，汽化溫度50℃，增益值5.0；Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測波長230 nm，柱溫25℃，進樣量20 μL。梯度洗脫：0～8 min，20%A；8～15 min，30%A；15～30 min，30%～43%A；30～40 min，43%～60%A；40～60 min，60%～100%A；60～65 min，100%～20%A。

1.3.4 標準曲線的繪制 分別精確稱取對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和黃芪皂苷Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、I于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成濃度為1.870、1.360、1.362、0.601、0.552、1.254、0.979、0.500、0.582、1.972 mg/mL的貯備液。貯備液分別逐級稀釋，配制成系列濃度并經0.45 μm濾膜過濾后，進樣20 μL測定并繪制標準曲線。6種黃酮類成分，以橫坐標為進樣量（濃度）(X)、縱坐標為峰面積(Y)進行線性回歸；4種皂苷成分，以進樣量（濃度）的對數(x)為橫坐標、峰面積的對數(y)為縱坐標進行線性回歸；回歸方程及其線性范圍見表1，對照品色譜圖見圖1。

表1 黃芪10種藥效成分的回歸方程

1.3.5 樣品測定 取各組次樣品按1.3.2處理后測定。黃酮類成分對照品溶液和供試品溶液分別進樣20 μL；皂苷類成分對照品溶液、供試品溶液分別進樣10、20 μL。記錄色譜峰的峰面積，用外標法計算各成分的含量。樣品色譜圖見圖1。

1.3.6 數據處理 采用Microsoft Excel 2016處理數據，SPSS 16.0進行方差分析。各處理間每個組分的顯著性差異比較采用Duncan’s新復極差檢驗(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 HPLC-UV-ELSD測定結果

圖1 中不同處理的10種成分在2種檢測器中得到了良好的響應，且出峰時間基本一致。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪皂苷Ⅰ的保留時間分別為9.789、19.398、21.14、21.917、24.298、35.014、25.455、26.03、31.096、38.713 min，各色譜峰的峰形良好，與前后峰的分離度符合要求，基線也較為平坦，能夠滿足不同成分含量變化測定的要求。測定完成后，將6種黃酮的含量相加得到總黃酮的含量，4種皂苷的含量相加得到總皂苷含量。

圖1 黃芪10種藥效成分的HPLC圖譜

2.2 芽孢桿菌對黃芪藥效成分的影響

與對照組相比，黃芪幼苗澆注芽孢桿菌SXKF16-1和SXKF16-2的發酵液后，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、異黃烷苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅳ的含量均無明顯變化，而黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅲ的含量在2株菌發酵液澆注處理后均顯著升高（表2）。同時，SXKF16-1和SXKF16-2處理間對毛蕊異黃酮和芒柄花素的影響存在差異，前者的處理組中這2種成分的含量均顯著高于后者。從總黃酮和總皂苷含量的變化看，2株拮抗芽孢桿菌處理后總黃酮含量與對照組差別不明顯，總皂苷的含量相較于對照組明顯升高（圖2）。

表2 芽孢桿菌處理組與對照組黃芪中10種成分的含量比較 mg/g

圖2 芽孢桿菌處理組與對照組黃芪總黃酮和總皂苷含量比較

3 討論

研究結果表明，拮抗芽孢桿菌SXKF16-1和SXKF16-2的發酵液澆注黃芪幼苗后，其根內總黃酮成分含量都沒有明顯變化，但是總皂苷類成分含量均明顯升高，這一變化主要來源于黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅲ含量在2組處理中的顯著升高。可見，菌株SXKF16-1和SXKF16-2對黃芪部分皂苷類藥效成分有促進積累的作用。在黃酮類成分毛蕊異黃酮和芒柄花素的測定中發現，盡管2株菌處理后這2種成分的含量變化與對照相比無明顯差異，但不同的菌株處理間呈現出了差異性的變化。這一現象表明，不同的芽孢桿菌對黃芪藥效成分的影響并不完全相同，其原因可能在于不同的芽孢桿菌與黃芪的互作機制不同，進而造成黃芪藥效成分產生或積累的差異。同時需注意的是，本研究測定的是拮抗菌發酵液整體對黃芪藥效成分的影響，體現的是菌體和發酵代謝產物共同作用的效果。因此，具體是何種因素對黃芪藥效成分的代謝變化起到主要作用，還需進一步研究。

葉如夢等[25]在營養土環境中接種枯草芽孢桿菌B117顯著降低香蜂花總酚及迷迭香酸(RA)的含量，在相對貧瘠環境中接菌則沒有顯著影響，推測該菌株對香蜂花次級代謝產物的作用依賴于土壤營養條件。由此，在后期深入評價菌株SXKF16-1和SXKF16-2對黃芪藥效成分含量的影響時，還應考慮施用地土壤因素的作用。

測定中藥材有限成分的含量并不能全面、準確地反映其質量的優劣[26]，本研究僅針對黃芪的10種主要藥效成分進行測定，無法反映其活性成分的整體變化。近年來，以組群指標分析為基礎的植物代謝組學技術在分析植物在非生物或生物脅迫下的應答機制方面已經取得了很大進展[27]，并在中藥材質量的整體評價中顯示出了巨大優勢[26]。利用該技術研究芽孢桿菌對藥用植物活性成分的影響，將更有利于從整體變化的層面來準確評價其作用。

另外，本試驗中黃芪皂苷I的含量較其他文獻中報道的偏高。由文獻可知，黃芪中皂苷80%以上分布在表皮[28]，且總皂苷生長3年含量達到最高，除3年生黃芪外，皂苷含量隨著生長時間的延長含量逐漸降低[29]，可見黃芪的生長時間對皂苷含量有顯著影響。本試驗所用黃芪的生長時間僅有6個月，根相對較細，表皮在根重中占有較大的比例，這可能是導致所測得的皂苷含量與其他報道不盡一致的直接原因。

4 結論

黃芪根腐病拮抗芽孢桿菌SXKF16-1和SXKF16-2發酵液的施用，對黃芪黃酮類活性成分的積累無顯著影響，但可促進皂苷類成分特別是黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅲ含量的升高，表明供試芽孢桿菌具有提高移栽黃芪藥效成分，改善其品質的潛力，但不同菌株的作用效果具有一定差異。研究結果為將上述菌株開發為多功能制劑，針對性地緩解黃芪規模化生產中根腐病嚴重發生和主要藥效成分含量降低的問題，提供了有效的理論依據。