MS培養(yǎng)基不同成分對馬鈴薯脫毒試管苗生長的影響

賈小霞，齊恩芳，劉 石，黃 偉，呂和平，文國宏，馬 勝

（1甘肅省農業(yè)科學院馬鈴薯研究所，蘭州730070；2甘肅省馬鈴薯種質資源創(chuàng)新工程實驗室，蘭州730070；3農業(yè)農村部西北旱作馬鈴薯科學觀測實驗站，甘肅渭源748201）

0 引言

隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的推進，馬鈴薯種植面積日益增加[1]。然而，在馬鈴薯生產中，病毒病的普遍發(fā)生導致馬鈴薯的產量降低和商品性狀退化，而且隨著種植年限的增加逐年加重，嚴重制約著馬鈴薯產業(yè)的持續(xù)、健康發(fā)展[2-3]。馬鈴薯脫毒種薯的繁育和推廣可以從根本上抑制病毒病的發(fā)生和蔓延，是馬鈴薯產業(yè)發(fā)展的重要保障[4-5]，脫毒試管苗的擴繁是脫毒種薯繁育的一個重要環(huán)節(jié)[6-7]，培養(yǎng)基是脫毒試管苗生產的基礎[8]。目前，馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)試管苗快繁大多采用MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分是影響試管苗生長的重要因素，不同品種對營養(yǎng)元素的需求也有差異[9]。‘費烏瑞它’較適應含高氮、磷、鉀的MS培養(yǎng)基，‘中薯3號’較適應常規(guī)含量的MS培養(yǎng)基[10]，‘新大坪’在含9 mmol/L氯化鈣的MS培養(yǎng)基上生長狀態(tài)最佳[11]，‘克新13號’和‘克新1號’在僅含大量元素的MS培養(yǎng)基上葉大色綠，株高和莖粗均與常規(guī)培養(yǎng)基上的脫毒苗無顯著差異[12]，生長在缺P培養(yǎng)基上的‘鄂馬鈴薯3號’脫毒苗的植株生長形態(tài)、生物產量均較缺N高[13]。在保證高質量的前提下，降低成本有利于脫毒種苗與種薯的產業(yè)化發(fā)展，不添加有機物（包括肌醇）的MS培養(yǎng)基與全量添加的MS培養(yǎng)基上生長的試管苗的農藝性狀基本一致[14]，本課題組的長期生產試驗也證實了這一觀點，為了節(jié)省成本，生產中大都用不添加有機物的MS培養(yǎng)基替代全量添加的MS培養(yǎng)基。可以看出，為了節(jié)省成本和簡化試驗，前人做了大量研究，但不同品種對營養(yǎng)元素的需求存在較大差異。‘隴薯7號’因為其抗病、高產、優(yōu)質、廣適的特點，被農業(yè)部確定為2014年主導品種，不僅在甘肅省每年種植面積超過13.33萬hm2，在陜西、寧夏和青海等其他西北地區(qū)也有大面積種植[15]，近幾年在廣東、廣西、福建等南方冬作區(qū)也有較大面積的種植[16]。‘隴薯20號’是具有抗病、優(yōu)質、高產等特性的早熟新品種，具有很好的應用前景，篩選這2個品種脫毒苗快繁的最佳培養(yǎng)基，是滿足全國脫毒種薯全覆蓋的重要基礎，但關于這2個品種培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗目前尚未見報道。因此，本研究以‘隴薯7號’和‘隴薯20號’脫毒試管苗為試驗材料，以MS為基本培養(yǎng)基，研究缺鈣、鐵和微量元素對試管苗生長的影響，旨在篩選‘隴薯7號’和‘隴薯20號’脫毒苗高效低成本快繁培養(yǎng)基的同時，為馬鈴薯脫毒苗快繁生產中培養(yǎng)基的進一步優(yōu)化提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料馬鈴薯栽培品種‘隴薯7號’和‘隴薯20號’，為甘肅省農業(yè)科學院馬鈴薯研究所種質資源與生物技術研究室繼代培養(yǎng)的脫毒苗，每25～30天在MS培養(yǎng)基上繼代繁殖1次，培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強度為2000～2500 lx，光照周期為16 h/d。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 分別設含MS培養(yǎng)基不同成分的培養(yǎng)基8組，培養(yǎng)基成分見表1。所有處理均添加4.5 g/L瓊脂，30 g/L白糖，調節(jié)pH 5.8～6.0。在無菌條件下，選取生長健壯的馬鈴薯試管苗，切成帶1個腋芽的莖段，接種到上述8種培養(yǎng)基中，每瓶接10株，每個處理12瓶，3次重復。接種后將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)室，在23±2℃、光照周期為16 h/d的條件下培養(yǎng)，第30天時，進行相關指標的測定。試驗于2020年2—8月份在甘肅省農業(yè)科學院馬鈴薯研究所組織培養(yǎng)室進行。

表1 培養(yǎng)基

1.2.2 測定項目 試管苗培養(yǎng)30天時進行取樣調查，每個處理隨機抽取3瓶，測定株高(cm)、活葉數（片/株）、莖粗(mm)、植株鮮重(mg/株)、植株干重(mg/株)。采用直尺測量植株株高（植株莖基部到生長點的高度，cm）；采用數顯游標卡尺測量莖基部的直徑即為莖粗(mm)、根莖葉干重(mg)采用烘干法測定，即測完鮮重(mg)后，于105℃殺青30 min后，80℃烘干至恒重。

葉綠素含量的測定：取新鮮的試管苗0.25 g，加入少量CaCO3和石英砂，加入1 mL 80%的丙酮研磨成勻漿，轉入15 mL離心管中，再用5～8 mL 80%的丙酮洗滌研缽，一并轉入離心管，在避光環(huán)境下靜置數小時，待組織變白后進行離心，離心后棄沉淀，上清液用80%的丙酮定容到10 mL后，使用UV-5800型紫外分光光度計測定663 nm和645 nm處的OD值，以80%的丙酮調零。

1.2.3 數據處理 數據整理采用Microsoft Excel 2010；單因素方差(One-way analysis，ANOVA)統(tǒng)計分析采用DPS V3.01軟件；差異顯著性采用Duncan’s法進行分析。

2 結果與分析

2.1 缺微量元素對試管苗生長的影響

與1號相比，2號培養(yǎng)基缺微量元素。接種13天時，兩品種在1號和2號培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠，植株生長正常；培養(yǎng)30天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常，‘隴薯7號’的株高、莖粗、葉片數、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異（表2和圖3）；‘隴薯20號’的莖粗、葉片數、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異，但1號培養(yǎng)基上試管苗的株高顯著高于2號（表3和圖3）。

表2 MS培養(yǎng)基不同成分對‘隴薯7號’試管苗生長的影響

表3 MS培養(yǎng)基不同成分對‘隴薯20號’試管苗生長的影響

2.2 缺鐵對試管苗生長的影響

與1號相比，3號培養(yǎng)基缺鐵。接種13天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常，3號培養(yǎng)基上的試管苗雖發(fā)出新芽，但葉片白化，植株生長受阻（圖1 A）；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常（圖2 A）。培養(yǎng)30天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，生長正常，而3號培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，植株全部死亡（圖1 B）；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠，植株生長正常，且株高、莖粗、葉片數、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異（表3和圖3）。

圖1 ‘隴薯7號’試管苗

圖2 ‘隴薯20號’試管苗

2.3 缺鈣對試管苗生長的影響

與1號相比，4號培養(yǎng)基缺鈣。接種13天時，2個品種在1號和4號培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長正常（圖1A、圖2A）。培養(yǎng)30天時，2個品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常。‘隴薯7號’植株的莖粗和葉片數在各處理間無顯著差異，而4號培養(yǎng)基上的試管苗株高、莖葉鮮干重均顯著高于1號（表2），葉綠素含量顯著低于1號（圖3）；‘隴薯20號’植株的莖粗、葉片數和莖葉鮮干重在兩處理間無顯著差異，1號培養(yǎng)基上的試管苗株高顯著高于4號（表3），但4號培養(yǎng)基上的試管苗葉綠素含量顯著高于1號（圖3）。

2.4 同時缺乏微量元素和鐵鹽對試管苗生長的影響

與1號相比，5號培養(yǎng)基同時缺乏微量和鐵鹽。接種13天時，‘隴薯7號’在5號培養(yǎng)基上的試管苗株高稍低于1號，但葉色濃綠、植株生長正常；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上都葉色濃綠、植株生長正常。培養(yǎng)30天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常，‘隴薯7號’除株高和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異外（表2、圖3），5號培養(yǎng)基上試管苗的莖粗、葉片數和莖葉鮮干重均高于1號（表2）；‘隴薯20號’植株的株高在5號培養(yǎng)基上顯著低于1號，葉綠素含量顯著高于1號，莖粗、葉片數和莖葉鮮干重在兩處理間無顯著差異（表3、圖3）。

2.5 同時缺乏微量和鈣鹽對試管苗生長的影響

與1號相比，6號培養(yǎng)基同時缺乏微量和鈣鹽。接種13天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長正常，但6號培養(yǎng)基上的株高略低于1號（圖1A和圖2A）。培養(yǎng)30天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常。‘隴薯7號’在6號培養(yǎng)基上的株高顯著低于對照，莖粗顯著高于1號，葉片數、莖葉鮮干重和葉綠素含量與1號無顯著差異（表2和圖2）；‘隴薯20號’在6號培養(yǎng)基上的株高和葉綠素含量分別顯著低于和高于1號（表3和圖3），但莖粗、葉片數、莖葉鮮干重在兩處理間無顯著差異（表3）。

圖3 MS培養(yǎng)基不同成分對試管苗葉綠素含量的影響

2.6 同時缺乏鐵鹽和鈣鹽對試管苗生長的影響

與1號相比，7號培養(yǎng)基同時缺乏鐵鹽和鈣鹽。接種13天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常，7號培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，莖葉發(fā)黃，植株生長緩慢；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長正常（圖1A、圖2A）。培養(yǎng)30天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，生長正常，而7號培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，植株全部死亡（圖1B）；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗均葉色濃綠，植株生長正常，7號培養(yǎng)基上試管苗的株高、莖粗、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于1號（表3和圖3）。

2.7 試管苗在只含MS大量元素培養(yǎng)基上的生長情況

與1號相比，8號培養(yǎng)基只含MS大量元素。接種13天時，2個品種在1號培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常，在8號培養(yǎng)基上的試管苗莖葉微黃；培養(yǎng)30天時，2個品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗均葉色濃綠，植株生長正常，‘隴薯7號’在8號培養(yǎng)基上試管苗的株高、莖葉干重和葉綠素含量高于1號培養(yǎng)基，但未達到顯著水平，而莖粗、葉片數和莖葉鮮重均顯著高于1號（表2、圖3）。‘隴薯20號’在8號培養(yǎng)基上的葉綠素含量顯著高于1號（圖3），株高、莖粗、葉片數和莖葉鮮干重與1號無顯著差異（表3）。

3 討論與結論

MS培養(yǎng)基是馬鈴薯組織培養(yǎng)中最為常用的基本培養(yǎng)基之一[17]，培養(yǎng)基的成分主要包括大量元素(KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4)、鈣鹽(CaCl·2H2O)、微量元素(MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CoCL2·6H2O、CuSO4·5H2O)、鐵鹽(Na2EDTA、FeSO4·7H2O)、有機（煙酸、VB6、VB6和甘氨酸）和肌醇。培養(yǎng)基成分直接影響試管苗的生長[18]。鐵是葉綠素形成不可缺少的元素，在植株體內很難轉移，鐵元素的缺乏會改變葉綠素的合成，使植物葉片黃化，表現為“失綠癥”[19]。本研究中，2個參試品種（‘隴薯7號’和‘隴薯20號’）對鐵元素缺乏的反應不一樣。以除去有機的MS培養(yǎng)基為對照，接種在不添加鐵鹽培養(yǎng)基上的‘隴薯7號’試管苗莖葉白化，生長完全被抑制，這與陳永波[20]關于缺鐵抑制鄂馬鈴薯3號脫毒試管苗生長的研究結果一致；而‘隴薯20號’在不添加鐵鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，植株生長正常，且株高、莖粗、葉片數、莖葉鮮干重和葉綠素含量與對照無顯著差異，這說明馬鈴薯不同品種對鐵元素的需求量有很大的差異。

鈣是植物生長發(fā)育必不可少的一種大量元素[21]，適量濃度的鈣對植物的生長是有益的，可增加植株鮮重、干物質含量、根冠比和形成壯苗，植物缺鈣時，生長旺盛組織的生長會受到抑制，導致植株高度、葉片數量及生物產量下降[22]。本研究發(fā)現，接種在不添加鈣鹽的培養(yǎng)基上時，2個品種都能正常生長，‘隴薯7號’試管苗除葉綠素含量低于對照外，株高、葉片數、莖葉鮮干重均顯著高于對照，這與杜強[11]等關于缺鈣導致馬鈴薯栽培品種‘新大坪’試管苗的株高、葉片數、莖葉和根鮮干重均顯著低于常規(guī)MS培養(yǎng)基上生長植株的結果不盡一致。‘隴薯20號’的株高顯著低于對照，這與杜強[11]等關于缺鈣不利于‘新大坪’試管苗生長的研究結果基本一致。這表明鈣元素對馬鈴薯試管苗的生長有促進作用，缺鈣對生長的影響因品種各異。有趣的是，‘隴薯20號’在同時缺乏鐵鹽和鈣鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，株高、莖粗、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于對照，意味著鐵鹽和鈣鹽在‘隴薯20號’試管苗的生長過程中有相互協(xié)同作用，這還有待進一步研究。

微量元素在植物的生長發(fā)育中需求較少，但對植物的生長發(fā)育卻產生重要作用，特別是在植物的光合作用、呼吸作用、能量代謝等重要生理過程中起著至關重要的作用。陳永波[20]等采用不完全營養(yǎng)液法研究微量元素的缺乏與過量對脫毒馬鈴薯苗生長的影響時發(fā)現營養(yǎng)液中缺乏錳元素時，會表現出葉片較小，舒展不開，且出現卷曲，缺少Cu、Zn、Mo時無明顯癥狀表現。本研究發(fā)現，以除去有機的MS培養(yǎng)基為對照，全量省去微量元素對‘隴薯7號’沒有產生明顯的不利影響，試管苗的株高、莖粗、葉片數、莖葉鮮干重和葉綠素含量等各指標與對照無顯著差異，這與劉衛(wèi)平[12]以‘克新13號’和‘克新1號’為材料的研究結果一致。‘隴薯20號’在全量省去微量元素或同時省去鈣鹽和微量元素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，除株高顯著低于對照外，莖粗、葉片數和莖葉鮮干重與對照無顯著差異，這與陳永波[13]以‘鄂馬鈴薯3號’脫毒試管苗為研究對象時，缺乏微量元素導致植株葉片先出現褐色斑點直至最后形成爛葉的研究結果不同，這種不同可能來源于品種的差異；在只含MS大量元素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，‘隴薯7號’和‘隴薯20號’在前期均出現莖葉微黃的現象，但隨著培養(yǎng)時間的延長，微黃現象逐漸消失，培養(yǎng)30天時，‘隴薯7號’的株高、莖粗、葉片數、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于對照，‘隴薯20號’的各指標與對照無顯著差異。為了保證試管苗質量，通過比較所設8種培養(yǎng)基上試管苗的生長指標，發(fā)現‘隴薯7號’和‘隴薯20號’分別可以在MS大量元素+4.5 g/L瓊脂+30 g/L白糖和MS大量元素+微量元素+4.5 g/L瓊脂+30 g/L白糖的培養(yǎng)基上高效快繁。

本研究只對‘隴薯7號’和‘隴薯20號’的快繁培養(yǎng)基進行了研究，但馬鈴薯不同品種對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的需求存在較大差異，為了達到高效低成本的快繁目的，在實際生產中應針對不同品種進行進一步優(yōu)化。與生產中普遍用常規(guī)MS全量培養(yǎng)基快繁試管苗相比，用只含大量元素的MS培養(yǎng)基快繁全國主導品種‘隴薯7號’脫毒試管苗，不僅操作簡單、而且大幅度降低了成本，為滿足國家馬鈴薯脫毒種薯全覆蓋的需求奠定了基礎。