nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答的研究進展

馬 悅，于 冰

（1黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，哈爾濱150080）

0 引言

由nsLTPs基因編碼的非特異性脂質轉移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTPs)具有促進磷脂在細胞膜間轉移的能力并因此命名[1-2]。nsLTPs在植物界廣泛分布，屬于醇溶蛋白超家族[3]，具有促進兩親分子在細胞膜間交換和轉移的能力，兩親分子指既具有親水性、又具有親脂性的分子，例如：磷脂、糖脂、類固醇、酰基輔酶A和脂肪酸等[4]。

nsLTPs在植物的生長發育中發揮重要作用，主要參與植物種子萌發、角質層蠟形成[5]、表皮細胞毛狀體形成[6]、細胞壁延伸過程[7]，同時參與調控根瘤共生[8]、植物激素反應和光合作用等過程[9]。隨著對nsLTPs功能研究的不斷深入，發現nsLTPs在植物生物及非生物脅迫應答中發揮重要作用，但是對于此方面的研究缺乏全面的梳理，鮮有綜述報道。本文主要闡述了植物非特異性脂質轉移蛋白nsLTPs的結構特點、亞細胞定位及分類，并結合近年來的研究報道，重點介紹了nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答的最新研究進展，總結了植物不同物種中nsLTPs基因響應生物脅迫、非生物脅迫的調控途徑，以期為相關領域的科研人員提供借鑒和參考。

1 nsLTPs的結構特點、亞細胞定位及分類

1.1 nsLTPs的結構特點及亞細胞定位

nsLTPs相對分子量較小，一般為7k～10kDa[10]，等電點8.8～10，是一種小肽[11]，每個小肽中含有8個高度保守的半胱氨酸殘基骨架，其一般形式為C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C[12]。除此之外，nsLTPs的N端具有疏水信號肽，是引導新合成的nsLTPs蛋白質向分泌通路轉移的短肽鏈[13]。nsLTPs靠近C端具有鈣調素(CaM)結合位點[14]，CaM結合位點可以調節nsLTPs與 Ca2+的相互作用[15]。

nsLTPs的8個半胱氨酸殘基通過4個二硫鍵進行結合[16]，可以將nsLTPs折疊成一個非常緊湊的結構——含有內疏水腔的三維結構[17]，賦予了nsLTPs熱穩定性和蛋白水解抗性[18]。該疏水腔充當脂類和其他疏水分子的結合位點[19]；疏水腔能夠在脂質雙層之間轉移各種脂質分子，能夠容納許多不同的配體，如：脂肪酸、脂肪酰基輔酶A、磷脂、糖脂和羥基化脂肪酸[20]。

Anthony等[21-23]對甘藍型油菜(BrassicarapaL.)中的BrLTP2.1蛋白進行了結構預測，BrLTP2.1蛋白全長為98個氨基酸，使用i-TASSER軟件對不帶N端信號肽的BrLTP2.1成熟氨基酸序列進行三級結構建模，預測結果顯示，與大多數nsLTPs一樣，BrLTP2.1具有由8個半胱氨酸殘基形成的4個α螺旋和4個二硫鍵（圖1），紅色為4個α螺旋（從N端到C端標記為H1～H4）、黃色為4個二硫鍵；基于其三級結構，預測了BrLTP2.1與脂質LP3（1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿）結合的疏水腔（圖2）[23]。

圖1 BrLTP2.1的結構建模

圖2 BrLTP2.1與脂質LP3結合

不同nsLTPs在細胞中的亞細胞定位不同，可以定位在質膜[23]、細胞壁或細胞質中[24]。

1.2 nsLTPs的分類

根據分子質量，nsLTPs分為兩種亞家族，分別是nsLTPⅠ和nsLTPⅡ亞家族[25]。LTPⅠ亞家族成員分子質量約為9k～10kDa，N端是長約21～27個氨基酸的疏水信號肽序列。LTPⅡ亞家族成員的大小約為7 kDa，N端是27～35個氨基酸組成的疏水信號肽序列[26]。LTPⅠ與LTPⅡ的疏水腔結構不同[27]，LTPⅠ亞家族成員具有隧道狀疏水腔，LTPⅡ亞家族成員有2個相鄰的疏水腔并且可塑性更大，因此脂轉移活性更大[28]。LTPⅡ亞家族成員的結構特點使其具有更高的脂質轉運能力[29]。LTPⅠ與LTPⅡ形成二硫鍵的配對方式不同，LTPⅠ亞家族成員中半胱氨酸殘基配對組合為1-6、2-3、4-7和5-8，LTPⅡ亞家族成員中半胱氨酸殘基配對組合為1-5、2-3、4-7和6-8[25]。

2011年，Edstam等[30]基于序列相似性、糖基磷脂酰肌醇(GPI)修飾位點、內含子位置和半胱氨酸殘基之間的間隔，又提出了一種nsLTPs的新的分類方式。該種分類方式保留了根據分子質量建立的LTPⅠ和LTPⅡ亞家族分類方式，另外建立了C，D，E，F，G，H，J和K型亞家族分類方式。具體分類見表1[18]，其中C代表nsLTPs中保守的半胱氨酸，X代表任意氨基酸，X的下角標數字代表氨基酸個數。

表1 nsLTPs的I、Ⅱ亞家族及C-K亞家族分類方式

2 nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答研究

在植物的生長過程中，植物會受到各種逆境脅迫的影響，包括生物脅迫和非生物脅迫，這些脅迫是植物的生存與發育過程中的不利因素，進一步會衍生出糧食減產以及品質下降等問題[3]。近年來，關于通過反向遺傳學技術研究nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答研究報道較多，本文總結了近年來在不同植物中nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答的相關研究[19-29]，見表2。以下分別對nsLTPs基因參與植物生物脅迫應答和非生物脅迫應答功能及調控途徑進行具體介紹。

2.1 nsLTPs基因參與植物生物脅迫應答研究

植物nsLTP基因在植物抵抗細菌和真菌侵襲的保護中起著關鍵作用[42]，目前在甘藍型油菜(Brassica rapaL.)、大麥(HordeumvulgareL.)、胡椒(Piper nigrumL)、煙草(NicotianatabacumL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)中進行了nsLTP基因參與生物脅迫應答功能研究[43]，表明nsLTP基因可以增強植物對真菌和細菌病原體的抗菌性，提高植物的抗病性[31-41]（表2）。

表2 nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答研究

續表2

nsLTPs具有抗菌性能[44]，是與病程相關的蛋白[32]，參與植物防御機制[45]。2018年，徐揚等[46]研究表明煙草中的NtLTPs能夠通過參與抗病信號轉導途徑進而提高植物的抗病性。NtLTPs是一種病程相關蛋白(pathogenesis related protein,PR protein)，青枯菌(Ralstoniasolanacearum)侵染煙草后，NtLTP4能夠通過增強活性氧的清除和降低氣孔開度來提高轉基因煙草對青枯菌的抗性。MAPK級聯信號通路在植物響應生物脅迫中發揮著重要的作用，創傷誘導蛋白激酶(Wound-induced protein kinase，WIPK)是 MAPK家族成員之一[3]。通過MAPK級聯信號通路NtNPK1-NtMEK2-NtWIPK進行信號傳遞，進一步繼續將信號傳遞給位于NtWIPK下游的NtLTP4，NtLTP4與NtWIPK存在互作關系，通過增強NtLTP4蛋白的穩定性來參與抗病防御過程，從而提高了煙草對的青枯病的抗病性[46]（圖3A）。

2.2 nsLTPs基因參與植物非生物脅迫應答研究

nsLTPs基因參與非生物脅迫應答有助于植物適應環境條件的變化[40]。nsLTPs家族成員能夠響應一種或多種非生物脅迫[3]，包括干旱、低溫、高溫、鹽堿、滲透脅迫、過氧化氫、重金屬脅迫等。nsLTPs還顯示出對非生物脅迫相關植物激素的應答反應，包括脫落酸(ABA)，水楊酸，茉莉酸甲酯和乙烯利等。

在植物中，已經報道nsLTPs基因受到多種非生物脅迫或植物激素的誘導表達。潘那利番茄(Lycopersiconpennellii)中的LpLtp1和LpLtp2基因受到干旱誘導表達[41]。無芒雀麥(Bromusinermis)中的BG-14基因在干旱、冷和熱等非生物脅迫下被誘導表達[39]。擬南芥中的LTP基因AtAZI1受到低溫、鹽脅迫以及乙烯誘導表達[35]。一種從冷脅迫的卷心菜葉中分離的脂質轉移蛋白同源物：冷凍保護素，可保護分離的葉綠體類囊體膜免受凍融損害[47]。目前在甘藍型油菜(BrassicarapaL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、玉米 (ZeamaysL.)水稻(OryzasativaL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、胡椒(PipernigrumL.)等植物中進行了nsLTP基因參與非生物脅迫應答功能研究，表明nsLTP基因可以增強植物對高溫、低溫、干旱和鹽等非生物脅迫抗逆性（表2）。

對于nsLTPs參與植物非生物脅迫應答的調控途徑只有少量相關報道；有報道顯示nsLTPs受上游蛋白（如轉錄因子、激酶或磷酸酶）調節[48]。

徐揚等[46]研究發現，在鹽脅迫下，NtLTP4過表達煙草中，NHX1和HKT1兩個關鍵的Na+轉運體的表達量明顯高于野生型；研究表明NtLTP4能夠通過調控NHX1和HKT1促進Na+向液泡的轉運以及Na+由地上向地下運輸這2個過程，增強煙草對Na+的清除，減弱了Na+對植物細胞的毒害作用，從而提高鹽脅迫的耐受性（圖3B），并通過降低蒸騰速率和氣孔開度增強對干早脅迫的耐受性[46]。

Guo等[49]研究發現，原核表達體系純化的擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)AtLTP3蛋白在體外能夠與脂類結合，轉錄因子AtMYB96通過直接和AtLTP3基因啟動子的直接結合，正調節AtLTP3蛋白參與植物對低溫和干旱脅迫的耐受能力（圖3C）。AtLTP3可以結合脂質并將其從細胞質轉移到細胞膜或細胞壁上，形成角質層蠟，從而保護植物免受和干旱脅迫的侵害。

Pitzschkea等[35]研究發現，AZI1是一種富含脯氨酸的nsLTPs蛋白質，是有絲分裂活化蛋白激酶3(MAPK3)的互作蛋白。在擬南芥中過表達AtAZI1基因，能夠加強AtAZI1與AtMAPK3互作，AtMAPK3將AtAZI1磷酸化后使其激活，最終導致轉基因植株的耐鹽能力明顯增強（圖3D）。

潘燕林等[23]研究發現，粟(SetariaitalicaL.)SiLTP基因的過表達提高了轉基因煙草和小米的抗鹽和抗旱能力。李聰等[50]研究發現，在非生物脅迫應答中起重要作用的SiARDP參與了ABA依賴的信號途徑，SiARDP轉錄因子可以與SiLTP基因啟動子區域的DRE元件結合并激活SiARDP的表達，進而激活SiARDP的靶基因，表達SiARDP基因可以使SiLTP基因轉錄水平上調，說明SiARDP轉錄因子通過調節SiLTP基因的轉錄水平提高，進而提高了轉基因植物的抗鹽和抗旱能力（圖3E）。

圖3 nsLTP基因參與生物脅迫和非生物脅迫應答的初步分子調控模式圖

3 展望

隨著研究的不斷深入，有關植物非特異性脂質轉移蛋白(nsLTPs)的研究被越來越廣泛關注，但是對于植物非特異性脂質轉移蛋白(nsLTPs)的功能研究仍存在問題。未來的研究方向：（1）在不同物種中，植物nsLTPs在響應逆境脅迫時的分子調控網絡仍需要進一步研究。（2）植物nsLTPs的獨特結構使其具有熱穩定性，并且能夠結合和運輸脂質，但此功能與植物響應逆境脅迫之間的聯系仍不明確。（3）為了深入挖掘植物nsLTPs的功能，需要深入了解植物nsLTPs蛋白修飾狀態在植物逆境應答中的作用。

綜上所述，全面闡明植物nsLTP基因在植物逆境脅迫應答過程中的調控途徑及功能仍然是一項艱巨的任務。隨著基因功能研究技術的不斷發展，將促進對nsLTP基因分子調控網絡的全面研究，為今后深入探究植物nsLTP基因應答逆境脅迫的分子機理奠定良好基礎。