芥子酸對Aβ1-42致PC12細胞損傷的改善作用及對BDNF/TrkB/ERK信號通路的影響

薛迪 劉宇超 汪娜 劉學偉

中圖分類號 R285;R741 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）10-1181-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.05

摘 要 目的：研究芥子酸對β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）誘導的大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞）損傷的改善作用，并探討其對腦源性神經營養因子（BDNF）/酪氨酸激酶B（TrkB）/細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路的影響。方法：將PC12細胞分為空白組、模型組和芥子酸低、高劑量組（50、100 μmol/L）。除空白組外，其余各組均用2 μmol/L的Aβ1-42誘導細胞損傷;建模24 h后，藥物組加入相應藥液，培養24 h。觀察各組細胞形態變化，檢測細胞存活率和細胞中BDNF mRNA的表達情況及其蛋白水平，以及TrkB、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表達情況，并計算p-ERK1/2與ERK1/2的比值（p-ERK/ERK比值）。結果：與空白組比較，模型組細胞突觸變短，細胞連接較松，貼壁性差，胞質較暗淡，胞漿中有較多顆粒，細胞存活率以及細胞中BDNF mRNA的相對表達量及其蛋白水平，TrkB、p-ERK1/2蛋白的相對表達量和p-ERK/ERK比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，芥子酸高劑量組細胞病理變化明顯改善，細胞存活率以及細胞中BDNF mRNA的相對表達量及其蛋白水平，TrkB、p-ERK蛋白的相對表達量和p-ERK/ERK比值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：芥子酸可改善Aβ1-42誘導的PC12細胞損傷，其作用機制可能與激活BDNF/TrkB/ERK信號通路有關。

關鍵詞 芥子酸;阿爾茨海默癥;β-淀粉樣蛋白1-42;腦源性神經生長因子;酪氨酸激酶B;細胞外信號調節激酶

Effects of Sinapic Acid on Improving PC12 Cell Damage Induced by Aβ1-42 and BDNF/TrkB/ERK Signaling Pathway

XUE Di1，LIU Yuchao2，WANG Na3，LIU Xuewei4（1. School of Pharmacy，Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 2. Office of Academic Research， Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China; 3. School of Basic Medicine，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China; 4. School of Mental Health，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study the improvement effects of sinapic acid （SA） on PC12 cell damage induced by Aβ1-42， and to investigate its effect on brain-derived neurotrophic factor （BDNF） /tyrosine kinase B （TrkB） /extracellular signal-regulated kinase （ERK） signaling pathway. METHODS： PC12 cells were divided into blank group，model group， SA low-dose and high-dose groups （50， 100 μmol/L）. Except for blank group， cell damage was induced by Aβ1-42 in other groups; 24 h after modeling，administration groups were added with the corresponding solution and cultured for 24 h. Morphological changes of cells in each group were observed. Cell survival rate， mRNA expression and protein level of BDNF，protein expression of TrkB，ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2） were detected. p-ERK/ERK ratio was calculated. RESULTS：Compared with blank group，the model group had shorter synapses，looser intercellular junctions，poor adhesion，dim cytoplasm and more granules in cytoplasm. Cell survival rate and mRNA expression and protein level of BDNF， the relative expression of TrkB and p-ERK1/2 protein， p-ERK/ERK ratio were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group，in SA high-dose group the pathological changes of the cells were significantly improved，the survival rate of the cells，the mRNA expression and protein level of BDNF，the relative expression of TrkB and p-ERK1/2 protein， p-ERK/ERK ratio were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS：SA can improve PC12 cells damage induced by Aβ1-42， the mechanism of which may be associated with activating BDNF/TrkB/ERK signaling pathway.

KEYWORDS? ?Sinapic acid; Alzheimers disease; Aβ1-42; Brain-derived neurotrophic factor; Tyrosine kinase B; Extracellular signal-regulated kinase

阿爾茨海默病（AD）是一種以認知障礙為主要表現的中樞神經系統退行性病變[1]。β-淀粉樣蛋白（Aβ）在腦內過度累積形成的淀粉樣蛋白斑塊是AD的典型病理特征[2]。Aβ主要包括Aβ1-40和Aβ1-42兩種亞型，其中Aβ1-42在AD患者腦內最具神經元毒性，易引起老年斑的形成[2-3]。

目前，美國FDA批準用于治療AD的藥物有兩類，一類是膽堿酯酶抑制劑，如多奈哌齊、加蘭他敏等;另一類是N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗藥，如鹽酸美金剛;但這兩類藥物均不能有效逆轉AD的進程[4]。2019年11月，國家藥品監督管理局批準了治療AD的新藥——九期一?（甘露特鈉膠囊，GV-971）的上市申請，該藥的主要成分是海洋褐藻中的低分子酸性寡糖類化合物，能夠通過調節腸道菌群的靶向腦-腸軸而改善患者的認知功能，從而治療輕中度AD[5]。由此可見，從天然藥物中尋找用于防治AD的有效成分是可行的。

芥子酸，又稱3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸，廣泛分布于水果、蔬菜、谷物中，其衍生物有芥子堿、丁香醛等。研究指出，芥子酸對AD、共濟失調、帕金森病等神經退行性疾病有一定的治療作用[6]。相關藥理實驗發現，芥子酸作為一種神經保護劑，能夠減輕Aβ1-42誘導的小鼠海馬CA1區神經細胞損傷，并能夠改善紅藻氨酸引起的小鼠認知障礙，提示該化合物可能對Aβ1-42誘導的神經元毒性具有拮抗作用，但其作用機制不詳[7-8]。另有研究報道，腦源性神經營養因子（BDNF）與酪氨酸激酶B（TrkB）受體結合后，可使TrK受體二聚化，從而激活細胞外信號調節激酶（ERK）/核糖體S6蛋白激酶（RSK）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等下游信號轉導通路，誘導信號級聯反應;BDNF將上游信號轉移至細胞核內，使部分核內的轉錄因子發生磷酸化，對神經元存活、突觸功能和突觸可塑性具有重要作用[9-10]。基于此，本研究在前期研究的基礎上，以BDNF/TrkB/ERK信號通路為研究切入點，探討芥子酸對Aβ1-42致PC12細胞損傷的保護作用機制，為開發防治AD的創新候選藥物提供科學的實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括DL-CJ-2NDII Ⅱ型超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）、Series 8000型CO2培養箱和QuantStudio 5型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、M200 PRO型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）、CKX41- A32PH型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、AL204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、5804R型離心機（德國Eppendorf公司）、C1000 Touch型基因擴增儀和Gel Doc XR型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）、S11-6-S型恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）、LDZH-200KBS型高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

芥子酸對照品（批號S30697，純度≥97%）購自上海源葉生物科技有限公司;Aβ1-42蛋白（批號bs-0107p）購自北京博奧森生物技術有限公司;RPMI 1640培養基（改良型，貨號SH30809.01）購自美國HyClone公司;胎牛血清（批號04-007-1A）購自美國BI公司;大鼠BDNF酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號E30664）購自北京誠林生物科技有限公司;RIPA細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑（100×）、BCA蛋白濃度試劑盒、特超敏ECL化學發光試劑盒（批號分別為P0013B、P1005、P0010S、P0018AS）均購自上海碧云天生物技術有限公司;磷酸酶抑制劑混合物（100×）（批號CW2383S）購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司;十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司;預染蛋白質Maker（批號26616）購自加拿大Fermentas公司;胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（100×）、噻唑藍（MTT）、脫脂奶粉（批號分別為TB150、P1400、M8180、D8340）均購自北京索萊寶科技有限公司;小鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號分別為151218、122826、122011）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司;兔ERK1/2、TrkB多克隆抗體（批號分別為11257-1-AP、13129-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司;兔磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）多克隆抗體（批號#4377）購自美國CST公司;總RNA提取試劑（RNAiso Plus）、PrimeScripTM RT reagent Kit（Perfect real time）試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH plus）試劑盒（批號分別為D9108A、RR037A、RR420A）均購自寶生物工程（大連）有限公司;PCR引物由上海生物工程股份有限公司設計、合成;所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞）購自中國科學院上海細胞生物研究所。

2 方法

2.1 Aβ1-42溶液的制備

將1 mg的Aβ1-42溶解于221.5 μL的水中，制成濃度為1 000 μmol/L的溶液，置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育24 h（培養條件下同），于-20 ℃保存，備用。

2.2 分組

根據課題組前期MTT實驗結果，Aβ1-42誘導PC12細胞損傷的最適濃度為2 μmol/L，芥子酸對PC12細胞損傷具有改善作用的濃度范圍為32～128 μmol/L。本研究將細胞分為4組，即空白組、模型組（Aβ1-42，2 μmol/L）和芥子酸低、高劑量組（50、100 μmol/L，以DMSO為溶劑）。

2.3 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞形態及細胞活性影響的檢測

采用MTT法進行檢測。收集對數期的PC12細胞，接種至96孔板中，每孔100 μL，使細胞密度為5×104 mL-1，按“2.2”項下方法分為4組，每組設置8個復孔，并設置不含細胞的凋零組。各組細胞置于培養箱中繼續培養24 h后，除空白組外，模型組和芥子酸低、高劑量組分別用終濃度為2 μmol/L的Aβ1-42作用24 h以誘導PC12細胞損傷;然后，芥子酸低、高劑量組加入相應濃度的芥子酸繼續培養24 h。將各組細胞置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，采用MTT法以酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率：存活率（%）=（實驗組OD值-調零組OD值）/（空白組OD值-調零組OD值）×100%。實驗重復3次。

2.4 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞中BDNF mRNA表達影響的檢測

采用實時定量PCR法進行檢測。按“2.3”項下方法接種、分組、造模、給藥，每組設置3個復孔。于給藥培養24 h后，收集細胞，使用RNAiso Plus快速提取各組細胞總RNA;以RNA為模板，將PrimeScripTM RT reagent Kit和SYBR? Premix Ex TaqTM配合使用以逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參基因，進行擴增。反應體系（25 μL）包括SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，40 個循環。BDNF上游引物為5′-AGGCTTGACATCATTGGCTGACAC-3′，下游引物為5′-GGCACTTGACTACTGAGCATCACC-3′，產物片段長度為135 bp;β-actin上游引物為5′-AGAGGCATCCTGACCCTGAAG-3′，下游引物為5′-GGTTGGCCTTAGGGTTCAGAG-3′，產物片段長度為128 bp。按2-ΔΔCT法計算其相對表達量，以空白組結果為“1”，計算其他各組的比值。實驗重復3次。

2.5 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞中BDNF蛋白水平影響的檢測

采用ELISA法進行檢測。收集對數期的PC12細胞，接種至6孔板中，每孔1.5 mL，使細胞密度為10×104 mL-1，按“2.2”項下方法分為4組，每組設置4個復孔。按“2.3”項下方法造模、給藥。于給藥培養24 h后，收集細胞，反復凍融使細胞破壞并釋放出胞內成分，于4 ℃下以2 000 r/min離心20 min，取上清液，于-80 ℃保存，備用。采用ELISA法以酶標儀檢測細胞中BDNF水平。嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作，實驗重復3次。

2.6 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞中TrkB、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達影響的檢測

采用Western blot法進行檢測。按“2.3”項下方法接種、分組、造模、給藥，每組設置3個復孔。于給藥培養24 h后，收集細胞，按照RIPA細胞裂解液-PMSF蛋白酶抑制劑-磷酸酶抑制劑體積比100 ∶ 1 ∶ 1配制細胞裂解液，每孔加入細胞裂解液100 μL提取細胞總蛋白，冰上裂解15 min后，以12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用BCA法測定總蛋白含量，加入5×Loading buffer于95 ℃下煮沸5 min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加至丙烯酰胺（用SDS、APS、TEMED、水等配制）凝膠中，以恒流（電流60 mA）電泳分離，再以恒壓（電壓75 V，2 h）轉膜;用5%脫脂奶粉于37 ℃下封閉1 h，加入TrkB、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 400），于4 ℃過夜，用TBST溶液清洗3次，每次5 min;加入相應二抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于37 ℃下反應1 h，用TBST溶液清洗3次，每次5 min;以ECL顯色后，置于凝膠成像系統上曝光成像。采用Image Lab 4.0.1圖像分析軟件檢測蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量，以p-ERK1/2與ERK1/2的比值（簡寫“p-ERK/ERK”）表示ERK1/2磷酸化水平。以空白組結果為“1”，計算其他各組的比值。實驗重復3次。

2.7 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。數據均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞形態及細胞活性的影響

倒置顯微鏡下，空白組細胞連接緊密，可見長短不一的突觸，部分突觸相互連結，細胞周圍有光圈且有立體感（圖1A）;模型組細胞突觸變短，細胞連接較松，貼壁性差，胞質較暗淡，胞漿中有較多顆粒（圖1B）;芥子酸低劑量組細胞突觸有輕微損毀，突觸較模型組增多，細胞圓潤性增強，細胞碎片變少（圖1C）;芥子酸高劑量組細胞突觸相對模型組增多變長，細胞密集且光圈變明顯（圖1D）。

MTT實驗結果顯示，與空白組比較，模型組細胞的OD值和存活率均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，芥子酸低、高劑量組細胞的OD值和存活率均有所升高，其中高劑量組顯著升高（P<0.01），詳見表1。

3.2 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞中BDNF mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組細胞中BDNF mRNA的相對表達量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，芥子酸低、高劑量組細胞中BDNF mRNA的相對表達量均有所升高，其中高劑量組顯著升高（P<0.01），詳見表2。

3.3 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞中BDNF蛋白水平的影響

與空白組比較，模型組細胞中BDNF蛋白水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，芥子酸低、高劑量組細胞中BDNF蛋白水平均有所升高，其中高劑量組顯著升高（P<0.05），詳見表2。

3.4 芥子酸對Aβ1-42誘導的PC12細胞中TrkB、ERK? ? 1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞中TrkB、p-ERK1/2蛋白的相對表達量和p-ERK/ERK比值均顯著降低（P<0.05），而ERK1/2蛋白的相對表達量無明顯變化（P>0.05）。與模型組比較，芥子酸高劑量組細胞中TrkB、p-ERK1/2蛋白的相對表達量和p-ERK/ERK比值均顯著升高（P<0.05），而ERK1/2蛋白的相對表達量無明顯變化（P>0.05）;此外，芥子酸低劑量組細胞的上述指標均無明顯變化（P>0.05），詳見圖2、表3。

4 討論

Aβ是誘發AD的關鍵病理產物，其中Aβ1-42可導致患者神經細胞凋亡、神經突觸脫失、認知記憶能力受損[11]。研究發現，Aβ1-42可損傷神經元信號通路，導致大鼠神經突觸損傷及學習記憶障礙;同時亦發現，AD患者血清中Aβ1-42水平顯著高于正常人群，且Aβ1-42異常與其輕度認知障礙相關[12-15]。中藥遠志可作用于中樞神經系統，能夠保護神經元、改善學習記憶功能[16]。本課題組前期研究發現，灌服遠志乙醇提取物后，大鼠腦脊液成分中可檢測到芥子酸，且遠志中寡糖酯和遠志皂苷的部分成分（如西伯利亞遠志糖A1、西伯利亞遠志糖A6、遠志糖苷B、3，6′-二芥子酰基蔗糖、黃花遠志素A等）均含有芥子酸殘基或其前體代謝產物（相關內容待另文發表），提示遠志中含有或經代謝可產生芥子酸，其可能是遠志保護神經元、改善學習記憶功能的重要成分之一。本實驗通過Aβ1-42誘導PC12細胞損傷，顯微鏡下可見損傷細胞突觸變短，細胞連接較松，胞質較暗淡，胞漿中有較多顆粒，細胞存活率顯著降低;但經100 μmol/L的芥子酸干預后，PC12細胞損傷明顯得到抑制，突觸明顯長于模型組，細胞密集且光圈明顯，細胞存活率也顯著升高。由此說明，Aβ1-42可抑制細胞生長，降低細胞活性，影響其正常形態;而芥子酸能明顯抑制Aβ1-42誘導的細胞損傷，改善受損細胞的形態，增強細胞活性，提示芥子酸具有保護PC12細胞、拮抗Aβ1-42誘導PC12細胞損傷的作用。

BDNF存在于大腦皮層、海馬等部位，主要參與合成突觸蛋白、促進突觸連接，可增強突觸可塑性、提高突觸傳遞效率、促進神經元發育、修復神經元損傷，對神經元的存活、分化等發揮重要作用，亦可改善患者的學習記憶障礙[17-18]。近年來研究發現，BDNF/TrkB信號通路的功能障礙可導致AD的發生，同時發現AD模型大鼠腦內BDNF水平下降;BDNF亦可以調節Aβ在大腦中的沉積，減少Aβ導致的大鼠神經元損傷[19-20]。本研究發現，Aβ1-42可抑制PC12細胞中BDNF蛋白水平及其mRNA的相對表達量;芥子酸可改善Aβ1-42導致的PC12細胞BDNF蛋白水平及其mRNA相對表達量的降低，表明芥子酸可通過提高BDNF水平來降低Aβ1-42的細胞毒性從而起到保護細胞的作用。

目前研究認為，BDNF發揮保護神經細胞的作用機制可能是其與神經細胞表面特異性TrkB受體相結合，刺激細胞內信號轉導，并啟動相關生物學反應，對神經元的存活、分化、增殖及突出可塑性起到關鍵作用[21]。研究指出，BDNF/TrkB信號通路的異常可引起認知障礙，多奈哌齊可通過激活該信號通路改善AD模型大鼠的認知功能下降;此外，TrkB信號通路還能夠抑制中間神經元內皮質抑制素的基因表達[22-24]。藥理學研究發現，向大鼠海馬組織注射Aβ1-42建立AD模型后，海馬中Aβ1-42含量明顯增加，TrkB蛋白表達明顯降低，海馬神經元受損、調亡[25]。本研究發現，Aβ1-42可導致PC12細胞TrkB蛋白表達降低，推測可能是由于細胞中BDNF蛋白表達下降，引起其結合性受體TrkB蛋白表達受到抑制，Aβ1-42的細胞毒性效應引起了失償反應;而經芥子酸干預后，TrkB蛋白表達明顯升高，說明隨著BDNF蛋白水平的升高，其特異性結合受體TrkB蛋白的表達得以補償性升高，表明芥子酸可以通過上調TrkB蛋白的表達而拮抗Aβ1-42誘導的細胞損傷。

BDNF與TrkB結合可進一步活化細胞內絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK1/2及PI3K/Akt等下游信號通路，調控神經遞質的合成和釋放[26]。其中，ERK是學習和記憶形成信號轉導通路中重要的信號分子，主要在神經元、膠質細胞中表達，激活ERK信號通路后，經三級級聯反應進一步激活RSK，使得環磷腺苷效應元件結合蛋白磷酸化，對神經細胞增殖與分化、細胞形態維持產生重要作用[27-29]。相關研究證實，ERK通路被抑制后，神經細胞活性也會下降，神經功能損傷會隨之加重，提示ERK信號通路的激活與神經保護有關[30]。本研究結果顯示，Aβ1-42使p-ERK1/2蛋白的相對表達量及p-ERK/ERK比值均顯著降低;使用高劑量芥子酸干預后，p-ERK1/2蛋白的相對表達量和p-ERK/ERK比值均顯著升高，說明Aβ1-42干擾了細胞外信號轉導通路。此外，模型組細胞中ERK1/2蛋白的相對表達量不變，但p-ERK1/2蛋白的相對表達量卻明顯降低;而芥子酸可通過促進磷酸化ERK1/2蛋白表達激活ERK信號通路，進而調控上游BDNF/TrkB信號通路，促進BDNF及其受體TrkB的表達，從而拮抗神經細胞的損傷、提高神經細胞活性。

綜上所述，芥子酸可改善Aβ1-42誘導的PC12細胞損傷，其作用機制可能與激活BDNF/TrkB/ERK信號通路有關。本研究可為芥子酸作為新的神經元保護劑提供相關分子生物學依據，但其具體的作用靶點仍有待后續進一步研究。

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（收稿日期：2020-12-14 修回日期：2021-04-20）

（編輯：鄒麗娟）