PCR技術及其在食品微生物檢測中的應用探討

丁 磊 田 虎 柳吉芹

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引言

PCR技術在食品微生物的檢測當中有著十分廣泛的應用。該方法能夠實現對于目標微生物的精確篩選，并能夠鑒定食品當中的微生物種類。PCR技術能夠對老百姓切實關心的食品安全問題提供技術手段。通過PCR技術能夠為百姓餐桌提供食品當中的微生物指標檢測依據，該技術在食品安全方面的應用能夠提高對于微生物指標檢測的效率和質量。

一、PCR原理與技術

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)技術的工作原理是根據DNA模板當中的特性進行模仿并復制。在一定的條件之下，以單鏈DNA作為模板進行復制的過程當中，利用人工合成的寡核苷酸作為引物，或者是根據實驗要求制定適合的寡核苷酸作為引物。還能夠有效利用耐熱DNA聚合酶促使該復制過程的完成。在整個復制過程當中，通常會用到20～40個PCR循環。每一個PCR循環當中都會分為三個步驟進行工作。高溫變性、低溫再生、適當溫度擴展，每一部分當中PCR都會進行對應的工作，從而保證DNA能夠得到有效復制。在高溫環境之下，隨著DNA的變性，氫鍵就能夠被打開，讓雙鏈變為單鏈。在低溫條件之下，寡核苷酸引物以其自身的特異性互補并聯結單鏈DNA模板，促使DNA再生。適當溫度當中PCR循環也在進行著工作。DNA聚合酶以單鏈DNA作為模板，沿著規定的方向進行運動，除此之外，還能夠在不同的方向中插入核苷酸，使相關引物延展合成模板的互補鏈。經過多樣化的變性再生與擴展，PCR循環不斷完成自身工作，有效擴展著DNA片段[1]。

引物:引物是PCR工作過程當中所需要運用的物質之一。想要成功的擴增DNA片段其兩側互補的寡核苷酸就需要引物在之間作為連接的橋梁。引物自身具有一定的特殊性，也正是因為自身的特殊性引物才能夠通過PCR反應過程擴增特異性。除此以外，引物的設計以及合成的質量都對PCR擴增有著最為直觀的影響。在正常情況下，引物應當位于要分析的DNA組當中最為保守的區域，一般引物的長度大概為15～30個堿基。由于引物之間不能夠進行互補，每個引物當中的堿基都不能夠過分的重復連續。不僅如此，自身的發夾結構也不能由引物構成。引物當中的特定tm值應盡量接近以及GC含量不能過高。

dNTPs:dNTP是4個核苷酸的混合物，是PCR反應所需的底物。當四個核苷酸的濃度相同時，核苷酸在PCR工作循環當中的摻入錯誤率可以降級到最小化。一般來說，dNTP在濃度為0.2mol/L時能夠更好的完成擴增片段的長度以及堿基組成的確定[2]。

DNA聚合酶:當前，用于PCR擴增的最常用的DNA聚合酶是Thermus aquaicus生產的TagDNAase，它具有出色的熱穩定性，可以承受94攝氏度的高溫，并且在該溫度下很短。最佳反應溫度為72攝氏度，在70攝氏度時催化核酸鏈擴展的速率為2800個核苷酸/分鐘。通常，在100l反應系統中通常會使用兩個單位DNA聚合酶，所使用的DNA聚合酶數量對PCR擴增效率以及其特異性都有著十分重要的影響。PCR技術正在持續發展過程當中，除了tag DNA聚合酶之外，耐熱PFU DNA聚合酶已經能夠廣泛應用到PCR反應當中。PFU DNA聚合酶是一種在高溫環境之下成年熱球菌產生的DNA聚合酶。到目前為止，這是耐熱性DNA聚合酶的最高速率，但擴增速率比TagDNA聚合酶低550個核苷酸/分鐘。此外，還使用了r Tth DNA聚合酶，為了能夠讓DNA模板能夠在PCR反應當中順利進行擴增，在進行擴增反應之前需要對相對應的RNA片段進行逆轉錄。r TthDNA聚合酶可以結合逆轉錄和聚合反應。一種可在RNA逆轉錄后直接擴增大量DNA片段的片段，大大減少了操作步驟并提高了效率[3]。

緩沖液:目前最為常用的PCR緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl(p H 8.3-8.8)系統。每種Tag酶都有相同的反應緩沖液，因此通常不建議將該緩沖液與其他制造商的Tag酶交叉使用。

Mg+:Mg+其濃度明顯影響PCR產物的特異性和產量，Mg+可以與陰離子(陰離子基團如磷酸鹽)進行結合，在PCR反應系統中，從引物、DNA模板或d NTPs當中都能夠獲得磷酸鹽，因此應選擇適當的Mg+以達到最佳反應效果，濃度通常為2-5mmol/L。

核酸模板:核酸模板是PCR反應當中的重要組成部分之一。PCR反應的過程當中，一般都利用細菌進行，一般的反應模板來源DNA是染色體或質粒。使用染色體的DNA作為模板的PCR擴增過程當中，所需要的標記酶數量相對較大，對于模板DNA的純度要求會更高。并且在反應的過程當中不會存在抑制性的DNA聚合酶活性蛋白酶。通常，PCR反應系統所需的模板量是目標序列的102-105拷貝。

二、將PCR技術應用于食品微生物檢測

(一)用于檢測食品樣本中的致病菌。傳統微生物檢測方法步驟繁瑣且費時費力，首先，必須將樣品濃縮并培養以檢測微生物，并且只有在樣品達到可檢測水平后，才能分離微生物，觀察形態學特征并進行生化鑒定。而且，常規樣品不能檢測難以手動生長的微生物。在所有細菌環境當中，編碼rRNA的基因處于一種高度保守的狀態，因此可以用PCR方法擴增其DNA片段，從而更加快速敏捷的對樣品進行檢測。值得一提的是，對檢測那些無法進行人工操作培養的細菌或者病原體微生物，PCR方法的優勢體現的更加明顯。想要讓PCR反應能夠更好的為食品檢測服務，就需要在準備過程當中，提取出一定的目標DNA。憑借離心或者是過濾的方式進行相應的細胞獲取，之后對其進行裂解，然后對得到的裂解細胞進行核酸的純化。使其適合于PCR反應。[4]。也可以直接將樣品中的細菌細胞進行裂解來得到核酸。

(二)用于檢測飲用水中的指示菌。水質測試基于對大腸桿菌的檢測。常規的檢測方法是培養革蘭氏陰性細菌和可以使用乳糖的細菌的方法，并且該檢測方法很復雜并且需要幾天的時間。然而，一些大腸桿菌菌株不表達-葡糖醛酸糖苷酶，因此有時會出現檢測失敗。PCR技術為檢測-半乳糖苷酶(lac)和-葡萄糖醛酸苷酶(uid)基因提供了更加靈敏的方式。lacZ和uid A基因的在進行PCR擴增的過程當中，分別需要對水樣當中的大腸菌群和大腸桿菌進行檢測。通常，擴增的lacZ同樣適用于同類型的生物進行選擇性的培養辦法，而擴增的uid A可以檢測大腸桿菌和瞪羚物種。因此，PCR方法更加靈敏。此外，在使用水源之前使用PCR檢測細菌更為安全，因為PCR反應可在數小時內完成。

(三)用于檢測和鑒定乳酸菌。通過比較32種現有雙歧桿菌和相關物種的16S rRNA基因的序列，不難發現，寡核苷酸序列通常位于1412到1432位。這樣的發現在所有雙歧桿菌當中都是同樣存在的，這一寡核苷酸序列可以作為雙歧桿菌進行特定的寡核苷酸片段。這一特定的寡核苷酸片段可以作為擴增雙歧桿菌16SrRNA基因片段進行PCR反應的引物。在進行反應時通常采用簡單的形式，用SDS進行細菌細胞的裂解，之后利用蛋白酶k作為去除多余蛋白質的作用物，以此獲得樣板DNA。在該條件下，雙歧桿菌都可以通過PCR擴增技術實現其模板復制、擴增，從而產生典型的1.35kb的核苷酸片段，該類型的片段只有雙歧桿菌產生，其他的細菌則不會產生該條帶。因此雙歧桿菌可以利用PCR技術進行檢測、鑒定和分類乳酸菌。

三、結束語

簡而言之，由于PCR技術可以快速，特異性地擴增所需的DNA片段和靶基因，在很多領域當中都發揮著十分重要的作用。尤其在近期發生的新冠肺炎疫情中，PCR技術在檢測新型冠狀病毒核酸領域也發揮著重要的作用。這也就是為什么PCR技術的發展會得到社會各界的廣泛關注。