熱應激誘導畜禽氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥反應的機制及營養調控措施

陸燦強 舒鄧群 臧一天

(江西農業大學動物科學技術學院，南昌市動物健康與安全生產重點實驗室，南昌330045)

熱應激是影響畜禽生產的主要環境應激之一，高溫熱應激給畜禽生產造成重大損失；熱應激引起畜禽的采食量下降、代謝增強、免疫功能下降，最終造成畜禽生長、生產和繁殖性能下降[1-3]。研究表明，在熱應激造成的損傷中，氧化應激占主要地位；熱應激會造成畜禽機體代謝增強，引起活性氧(reactive oxygen species, ROS)的過量積累并造成機體氧化-抗氧化失衡，發生氧化應激；進而引起組織細胞、蛋白質和核酸的氧化損傷[4-5]。熱應激狀態下，機體可激活核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)，并上調其下游的抗氧化酶基因的表達，從而提高抗氧化酶活性，這有利于提高機體組織細胞對ROS的清除能力[4]；熱應激啟動熱休克反應上調了熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)的轉錄與表達，這有利于維持氧化應激和蛋白質加工之間的平衡以及細胞結構和內環境的穩定[6-7]；而且，ROS和HSPs兩者都可以激活核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)進而啟動免疫和炎癥反應[8-10]，加速清除或恢復熱應激引起組織細胞的氧化損傷。

目前，熱應激引起氧化應激、熱休克反應以及免疫和炎癥反應的試驗研究常見報道[1,11-12]；然而，關于畜禽在熱應激條件下機體內氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥的機制，并歸納這三者相互關系的研究卻鮮有報道。熱應激是限制畜禽生產的主要因素，研究熱應激狀態下機體氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥反應的機制及三者的相互聯系，不僅有利于進一步認識熱應激造成機體損傷發生和發展的過程，還可以為預防和緩解畜禽高溫熱應激提供理論依據。本文就熱應激引起畜禽氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥反應的機制及三者之間的相互關系作一綜述。

Oxidative stress：氧化應激；Mitochondrial dysfunction：線粒體功能障礙；ROS：活性氧 reactive oxygen species；Nrf2：核轉錄因子E2相關因子2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2；HSF1：熱休克因子1 heat shock factor 1；IκB：抑制蛋白κB inhibitory κB；NF-κB：核轉錄因子-κB nuclear transcription factor-κB；HO-1：血紅素加氧酶-1 heme oxygenase-1。

1 熱應激誘導氧化應激的產生

由Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)、Nrf2、抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)組成的Keap1-Nrf2-ARE信號通路是調節機體抗氧化酶系統的重要通路[17]。在基礎生理狀態下，Nrf2在胞質內與Keap1結合組成Keap1-Nrf2復合體，并通過泛素化降解；在氧化應激狀態下，高水平ROS改變了Keap1的構象并引起Keap1-Nrf2復合體解離，Nrf2得以活化并進入細胞核與ARE結合，上調抗氧化酶的基因表達，提高機體消除ROS的能力，從而抵抗環境高溫等因素對機體造成的氧化損傷[17-18]。Keap1-Nrf2-ARE信號通路與熱休克反應產生的HSPs在預防或緩解熱應激誘導氧化應激對細胞和組織損傷方面發揮著重要作用；而且，Nrf2、熱休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)與啟動免疫和炎癥反應的關鍵因子NF-κB存在密切聯系[19-21]。一般而言，機體存在較強烈或較長時間氧化應激時，抗氧化防御系統受到破壞、且組織細胞受損程度超過了HSPs的保護和修復能力，這時Nrf2受到抑制，NF-κB通路被激活并引起炎癥反應的可能性更大；而輕度的氧化應激則有利于抗氧化酶和HSPs表達的代償性增加，增強機體的抗應激能力[4]。

2 氧化應激和熱休克反應

2.1 HSPs的產生

HSPs是機體處于應激狀態下表達的分子伴侶蛋白，廣泛存在于胞內線粒體、內質網和細胞核等細胞器中；根據同源程度以及分子質量大小，HSPs可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPs(HSP27、HSP33等)以及泛素這6個家族[7,22]；其中HSP70家族在體內分布最廣泛、表達量也最大。HSF1啟動熱休克反應的關鍵因子；在基礎生理狀態下，HSF1以無活性的單體形式存在；而當細胞處于應激狀態時，3個HSF1單體結合形成具有活性的HSF1三聚體，而后進入細胞核與熱休克啟動子結合，上調HSPs的轉錄與表達[6-7,23]；這在機體組織細胞的抗氧化防御體系中起到重要作用。胞內ROS和Ca2+參與HSF1的磷酸化以及HSPs表達的調節。研究顯示，熱應激增加小鼠肺臟成纖維細胞ROS的產生，ROS可介導p38 MAPK的活化，而p38 MAPK磷酸化后可誘導HSP70和HSP27的表達[24-25]。線粒體是調節胞內Ca2+濃度的主要細胞器[26]，也是ROS的靶器官之一[16,27]；線粒體脂質膜易受到ROS的攻擊并出現脂質過氧化反應，造成線粒體膜的流動性下降；而且，脂質過氧化反應及其產物(丙二醛)破壞了線粒體完整性，導致線粒體膜上的Ca2+-ATP激酶活性降低，最終引起胞內Ca2+濃度增加[28]。而Ca2+通過活化鈣調蛋白激酶(calcium-activated calmodulin，CaM)，進而影響HSF1的磷酸化過程[29]；體外試驗發現，上調CaM的表達提高了小鼠胚胎成纖維細胞HSF1的活性和HSP72的表達[30]。綜上所述，氧化應激因子(ROS)以及胞內Ca2+參與了HSF1的磷酸化以及HSPs表達的調節。

2.2 HSPs在氧化應激中的作用

HSPs的分子伴侶功能：熱應激常引起細胞生理狀態發生變化、亞細胞器功能的紊亂，內質網中的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白積累過量；HSPs發揮分子伴侶功能協助多肽的正確折疊和加工，并引導異常或變性蛋白降解，維持熱應激狀態下細胞結構和內環境的穩定[6-7,31]。如內質網上HSP27、HSP33可發揮分子伴侶功能，維持氧化應激和蛋白質加工之間的平衡能；而且，HSP27磷酸化后能與肌節的結構蛋白、細胞骨架結合，緩解了細胞因氧化應激而造成的肌球蛋白裂解和細胞死亡[31-32]。

HSPs的抗氧化作用：熱應激破壞線粒體結構完整性，導致呼吸鏈受到抑制，產生大量的ROS，ROS可以刺激HSPs的產生[29]。HSPs的抗氧化作用包括2方面：一是抑制線粒體呼吸中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活性，減少ROS的產生[7]；二是直接或間接刺激內源性抗氧化酶的產生，如HSP27可以促進谷胱甘肽自身的氧化還原循環過程，提高還原型谷胱甘肽的水平，調節機體ROS的平衡[33]。HSP70在體內分布最廣泛，熱應激增加了HSP70，有助于提高細胞的熱耐受性[12,34]。另外，HSP70具有抗細胞凋亡作用；HSP70可調節B淋巴細胞瘤-2(blymphocyte tumor-2，Bcl-2)的表達，而Bcl-2通過穩定線粒體膜和抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的釋放而起到了抗凋亡作用[35]。

3 氧化應激與免疫和炎癥反應

3.1 免疫和炎癥的激活

NF-κB最初作為淋巴細胞中免疫球蛋白κ輕鏈基因轉錄所需的核內轉錄因子而被發現；后來證明，NF-κB是一種幾乎存在于所有細胞的轉錄因子，廣泛參與機體的防御反應、細胞凋亡及其他應激反應[9]。NF-κB的激活與Nrf2相似；在基礎生理狀態下，NF-κB在胞質內與其抑制蛋白κB(inhibitory κB，IκB)結合形成無活性的復合物；在熱應激狀態下，IκB經磷酸化后與NF-κB解離，NF-κB得以活化并進入細胞核與靶基因結合，發揮轉錄調節作用，導致各種炎癥因子的產生，從而啟動炎癥反應[23]。輕度的氧化應激主要通過激活Keap1-Nrf2通路來提高機體的抗氧化防御系統；但機體出現較強烈或較長時間應激時，NF-κB通路激活并引起炎癥反應的可能性更大[4]。

3.2 氧化應激引起免疫和炎癥反應的途徑

氧化應激的主要因子(ROS)可通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)識別來啟動炎癥反應；TLRs主要表達于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等，是免疫細胞表面的模式識別受體；不僅能識別病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，也能識別因氧化應激而出現的損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)并誘導巨噬細胞的活化，啟動免疫反應[36-37]。因此，氧化應激狀態下，ROS的過表達從而被TLRs識別；ROS能通過TLR2-髓樣分化因子88-NF-κB途徑，啟動下游炎性基因的表達，產生白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子，調節機體的免疫功能[38]。ROS也能啟動Nalp-3炎性復合體(NACHT-LRR-PYD-containing protein3，Nalp-3)組裝和活化引起炎癥反應；Nalp-3由Nalp-3蛋白、接頭蛋白和效應蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)組成，是胞內模式識別受體[39]。在氧化應激狀態下，線粒體持續生成的ROS可以通過活化NF-κB而后激活Nalp-3[40]；此外，ROS也可活化ERK信號通路激活Nalp-3；激活的Nalp-3炎性復合體能促進白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)的成熟，從而啟動炎癥反應。另外，革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等具有病原體相關分子模式，也是誘導機體炎癥反應的因素之一。熱應激會使動物腸道產生的LPS通過腸黏膜屏障轉移到機體其他部位，而使血液中LPS水平的升高[41]。LPS進入血液后，與結合蛋白、特異性受體結合形成復合物后可被單核細胞、巨噬細胞識別，進而通過NF-κB路徑啟動炎癥反應[42]。

總之，氧化應激的主要因子(ROS)可通過NF-κB或Nalp-3誘導免疫炎癥發生[39-40,43]；而熱應激對免疫功能影響，因機體氧化應激程度而異。輕度的氧化應激對免疫系統起到積極效應，能夠提高機體對外界環境的適應性；當機體遭受較強烈或較長時間的熱應激時，大量內源性ROS以及由腸道轉移到機體內的LPS可誘發免疫和炎癥反應[42]。氧化應激與免疫系統可通過Nrf2和NF-κB等因子進行相互調節，Nrf2和NF-κB在組織中的表達保持著微妙平衡；NF-κB的輕度表達可刺激Nrf2的表達代償性增加，而當應激刺激過于強烈，這種平衡被打破，NF-κB過表達則會抑制Nrf2[4,20]。此外，熱休克反應與NF-κB也存在密切聯系[19,23]。

4 熱休克反應與免疫和炎癥反應

胞內HSF1及其下游表達的HSPs具有抑制炎癥的作用。HSF1可能競爭性抑制NF-κB介導的炎癥過程[23]；通過基因敲除技術發現，缺失HSF1基因的小鼠，增加了LPS引起的炎性因子(TNF-α、IL-6)的表達[44]；即HSF1基因的缺失會提高NF-κB的活性，加速炎癥反應的發展；這間接表明了HSF1具有抑制炎癥的作用。而且，HSPs也能感知胞內炎癥信號變化并作出應答；如HSP70與核因子抑制蛋白α(IκBα)相結合，抑制NF-κB通路從而抑制炎癥反應[45]。另外，細胞質內存在一種NF-κB的自然抑制因子I-κ，通常I-κ在胞漿內以與NF-κB結合或非結合的形式存在，熱休克應答可誘導I-κ基因表達，進而間接下調炎性因子的產生[19,23]。此外，HSPs具有免疫效應。當出現較為強烈的熱應激時，HSPs從細胞內分泌后釋放到胞外；同時，氧化應激造成的細胞壞死也會引起胞外熱休克蛋白(extracellular heat shock protein，eHSP)的增加[46]。eHSP70是目前已知的胞外熱休克蛋白主要成分；eHSP70可作為抗原肽的高效載體分子，在抗原遞呈、激活淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞等過程有重要作用[46-47]。值得注意的是，eHSP70可作為細胞壞死、組織損傷等危險信號激活免疫系統；eHSP70可被TLR2/4識別并激活髓樣分化因子88-NF-κB通路，從而調節免疫系統合成和釋放多種炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)[45-46]。

總之，HSPs對免疫和炎癥反應可表現出雙重的調節作用。一方面，HSPs可感知并抑制胞內的炎癥反應，提高細胞的存活能力；另一方面，eHSPs可作為危險信號刺激免疫系統釋放炎性因子，加速炎癥反應的發展以利于受損組織細胞的恢復或清除。

5 氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥反應的相互關系

氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥反應之間維持著動態平衡，這對于維持熱應激畜禽機體的穩態起到重要的作用。一方面，熱應激引起胞內ROS水平和Ca2+濃度升高，ROS和Ca2+可促發HSF1的磷酸化以及調節HSPs表達[29]；HSPs的上調有利于保護機體免受氧化損傷，且HSPs可分泌或釋放到胞外并參與到免疫和炎癥反應過程中[7,46]。另一方面，氧化應激因子(ROS)通過TLRs和Nalp-3激活免疫系統[39-40]，加速炎癥反應或免疫修復過程。而炎癥反應上調了ROS水平也會加劇氧化應激程度，過量的ROS則會引起免疫細胞氧化損傷、進一步降低機體免疫功能。Nrf2通路與熱休克反應在一定程度上可緩解熱應激引起的氧化應激[7,48]；而且，Nrf2、HSF1和NF-κB三者存在密切關聯(圖1)，共同維持氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥反應之間平衡，以利于組織細胞適應各種形式的氧化應激。

其一，出現氧化應激時，機體組織通過激活Nrf2上調抗氧化酶水平，加快消除過多的ROS，從而減少ROS介導的NF-κB激活[12,20]；而且，Nrf2可以阻止IκBα的降解，從而干擾NF-κB核轉位和促炎基因的轉錄[20]。反之，NF-κB可以調節Nrf2及其下游抗氧酶基因表達；p65(NF-κB的亞基)過表達能夠幫助Keap1的累積[21]，進而起到抑制Nrf2的作用。其二，HSF1可能通過競爭性抑制NF-κB介導的炎癥過程[44]；然而，NF-κB對HSF1是否存在負調控作用，即免疫炎癥反應對熱休克反應的調控作用，目前還缺乏足夠的認識。其三，HSF1和Nrf2兩者普遍表現出抗應激刺激效應；盡管沒證據顯示HSF1與Nrf2存在直接的關聯，但兩者存在共同的靶基因；HSF1與Nrf2的活化均可上調血紅素加氧酶1、接頭蛋白p62和HSPs轉錄基因的表達[48-49]，提高細胞應對有害刺激的存活能力；而且，p62的聚集可以激活Nrf2通路[50]，HSF1可能通過p62間接影響到Nrf2，但具體的機制尚未見報道。另外，通過基因敲除手段發現，HSF1激活的誘導劑濃度高于Nrf2激活誘導劑的濃度[48]；這提示Keap1-Nrf2通路的激活可能優先于HSF1。

總之，維持氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥反應之間的平衡是畜禽熱應激防治的關鍵點；而且，氧化應激狀態下HSF1、Nrf2與NF-κB相互緊密關系的闡明，有助于通過相應技術手段緩解熱應激；其中，利用飲食等營養調控措施以維持三者之間的平衡從而緩解畜禽熱應激的研究多有報道。

6 營養調控措施

6.1 維生素

維生素A、維生素E和維生素C是動物機體內主要的外源性抗氧化劑，能有效清除機體新陳代謝中產生的ROS，預防或緩解熱應激引起氧化應激對畜禽機體的損傷[51]。研究發現，維生素A通過Nrf2-谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)-NF-κB緩解奶牛乳腺上皮細胞氧化應激；維生素A激活Nrf2信號通路上調GPx1，而GPx1對抑制蛋白κB激酶和p65有抑制作用，能減少NF-κB的激活以及下游炎性因子的表達，最終減緩熱應激造成細胞的氧化損傷[52]。維生素E能將畜禽體內產生的ROO-自由基轉化為ROOH，發揮抗氧化作用[53-54]；此外，維生素E也是細胞膜脂質的組成成分，可有效清除細胞膜上的ROS，減緩細胞膜中多不飽和脂肪酸的氧化[55]。維生素C可緩解熱應激引起機體的氧化損傷，其作為電子供體，發揮還原劑功效，并可協助維生素E發揮抗氧化功能[54]；另有研究指出，維生素C能減少ROS的產生，從而緩解熱應激引起的HSPs的過表達[56]。飼糧中添加維生素C，可改善熱應激家禽高生產性能、繁殖性能以及產品品質等[56]，但其抗熱應激機制有待進一步研究。

6.2 礦物元素

6.3 植物提取物

白藜蘆醇、姜黃素和甜菜堿等植物提取物，具有抗氧化、抗炎和緩解應激等多種生物功能。白藜蘆醇可能通過Nrf2、NF-κB等通路發揮生物效應[12,61-62]。Sahin等[62]報道，熱應激使鵪鶉肝臟內Nrf2的表達明顯下調；通過補充白藜蘆醇(400 mg/kg)能上調熱應激鵪鶉肝臟中Nrf2的表達，提高SOD、CAT和GPx活性。此外，也有報道指出，白藜蘆醇能下調熱應激烏骨雞空腸組織NF-κB的表達，改善熱應激對腸黏膜的損傷[12]。白藜蘆醇可能通過降低IKK活性，阻止IκB的磷酸化，進而抑制NF-κB的活化[63]。姜黃素通過MAPK-Nrf2-ARE信號通路緩解熱誘導雞胚成纖維細胞的氧化應激[64]；姜黃素也可激活Nrf2介導的抗氧化酶系統，減輕熱應激肉雞肝臟氧化損傷[65]。甜菜堿具有促進畜禽動物生長、緩解應激等作用；甜菜堿可通過維持細胞滲透壓、調節細胞電解質平衡等生物學效應[66]，進而起到緩解動物熱應激作用；且體外試驗發現，甜菜堿通過減少ROS的產生來保護牛乳腺上皮細胞免受熱應激誘導的氧化損傷和細胞凋亡[67]。因此，利用植物提取物調節機體氧化應激、熱休克反應和免疫反應之間的平衡，可為防治畜禽熱應激提供新思路。

6.4 其他

腸道是熱應激的主要靶器官，熱應激誘導的氧化應激會引起造成腸道的損傷，如ROS攻擊腸黏膜蛋白上的巰基，引起功能性蛋白的活性下降甚至功能喪失[68-69]；而且，過氧化反應產物(丙二醛)破壞腸上皮細胞的緊密連接，增加腸黏膜屏障的通透性[70]。氨基酸營養物質如谷氨酰胺(glutamine，Gln)[71-72]和益生菌(地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌等)[73-75]可改善熱應激對動物腸道的負面影響。

Gln可作為能源物質滿足腸上皮細胞和淋巴細胞的增殖分化的需要，維持腸道正常的功能；動物長期處于熱應激時，內源性Gln無法滿足機體的需求，補充Gln對改善腸道屏障能產生一定的積極效應[72]。有研究認為，Gln可能通過PI3K-Akt或NF-κB通路調節腸上皮細胞緊密連接結構，減少應激引起腸道黏膜通透性的改變[76]。而且，Gln可作為HSPs的誘導劑，上調HSPs的表達[77]，進而提高機體的抗應激能力。另外，熱應激常會引起動物腸道菌群的紊亂；而益生菌能競爭性抑制有害菌群的增殖，維持腸道菌群平衡[78-79]。飼用益生菌能上調熱應激狀態下，肉雞空腸閉鎖蛋白mRNA的表達、改善腸絨毛高度[80]；益生菌可能通過減少TLRs-NF-κB通路的激活來緩解腸道炎癥反應[75,81]。另外，專家建議，益生菌與植物提取物、酸化劑或酶制劑等組合使用，會起到“1加1大于2”的應用效果[82]，其具體的調節氧化應激、HSPs表達以及免疫功能的機制還缺乏足夠的認識。

7 小 結

熱應激誘發氧化應激是造成畜禽機體損傷的關鍵因素，氧化應激因子(ROS)和HSPs均可激活免疫和炎癥反應；炎癥反應上調ROS水平則可加劇氧化應激，而氧化應激又會損傷機體免疫系統；Nrf2通路和熱休克反應在一定程度上可緩解熱應激引起的氧化應激。本文歸納了熱應激誘導畜禽氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥的機制及相互關系，并在此基礎上總結一些營養調控緩解熱應激的措施。然而，氧化應激、熱休克反應與免疫和炎癥這三者的更深層次聯系及其機制仍有待研究。例如NF-κB能否或如何調控HSF1，即免疫和炎癥反應對熱休克反應的影響？另外，HSF1與Nrf2的上調都有利于清除ROS，它們是否存在密切聯系？甚至，它們能否或如何影響線粒體的結構和功能？這些工作將有助于更深入的理解熱應激發生和發展，并可為緩解畜禽熱應激的營養調控提供新思路。