青錢柳葉提取物的抗氧化活性及其與黃酮含量的關(guān)系研究

毛傳亮，黃宏亮，董國庭，王麗玲，駱先有，柏明娥

（1. 慶元縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 慶元 323800；2.安吉縣林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 安吉 313300；3.安吉縣章村鎮(zhèn)人民政府，浙江 安吉 313301；4.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；5.龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 龍泉 323700）

青錢柳Cyclocarya paliurus系胡桃科Juglandaceae青錢柳屬Cyclocarya植物，為我國特有[1]。青錢柳的樹皮和葉具有清熱解毒、止痛功能，也可用于治療頑癬[2]。青錢柳中含有豐富的天然藥用成分，如多糖、黃酮、酚類、萜類、皂苷、香豆精、生物堿、有機酸、維生素E、咖啡因和人體必需的微量元素等[3-4]。目前，已從青錢柳中分離得到的化合物有70多種，大部分成分都來自青錢柳葉[5]。大量現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，青錢柳具有明顯的降血糖[6-7]、降血壓[8]、降血脂[9-10]、抗氧化[11-12]、抗腫瘤[13-14]和增強機體免疫功能[15-16]等作用，是很好的天然保健食品資源。我國自1970年起就對它的化學(xué)成分及其藥理作用進(jìn)行了大量研究，雖然有一定的發(fā)現(xiàn)，但其化學(xué)成分與藥理活性之間的相關(guān)性及其發(fā)揮功效的主要活性物質(zhì)等方面的研究還有待深入。本文采用溶劑萃取分離法，根據(jù)相似相溶原理，將青錢柳葉中性質(zhì)相近的組分集中用同一種溶劑進(jìn)行分離提取得到不同的提取物，再對各提取物進(jìn)行抗氧化活性的測定和活性成分的含量測定，以期為青錢柳的應(yīng)用和產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與實驗儀器

供試青錢柳葉采集自浙江省遂昌縣王村口鎮(zhèn)山井村，地理坐標(biāo)為119°04′53″ E，28°20′49″ N，海拔為1 059 m，系人工種植5年生苗。于2019年9月底采集植株上的全部鮮葉，攤晾后放置于陰涼的室內(nèi)使其自然萎凋，然后置烘箱內(nèi)于100℃高溫烘3～5 min后取出，冷卻后于塑料袋內(nèi)密封保存，使用前采用粉碎機粉碎至80目備用。

主要化學(xué)試劑：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水楊酸、雙氧水、苯酚、香草醛、冰醋酸、鄰苯三酚、L-抗壞血酸Vc、三羥甲基氨基甲烷、濃硫酸、鹽酸、三氯化鋁、高氯酸均為國產(chǎn)分析純（杭州匯普化工儀器有限公司）；1,l-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（艾覽（上海）化工科技有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）（上海晶純生物科技股份有限公司）。

實驗儀器：超聲儀（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院自制）、UV-759S型紫外-可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、HH-ZK1型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、GZX-9240MBZ型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、CPA124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、DLSB-1005型低溫冷卻液循環(huán)泵（杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）、PHS-25型數(shù)顯pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、真空冷凍干燥機（美國Labconco公司，F(xiàn)reeZone 2.5 L）。

1.2 試驗方法

1.2.1 青錢柳葉不同提取物的制備

1.2.1.1 青錢柳葉水提物的制備 稱取200 g青錢柳葉樣品，加8～10倍蒸餾水于90℃水浴回流提取2次，每次1 h，合并濾液后減壓濃縮、冷凍干燥后得青錢柳葉水提取物樣品。

1.2.1.2 青錢柳葉乙醇提取物的制備 稱取青錢柳葉樣品10 kg，加100 kg 95%乙醇進(jìn)行超聲提取2 h，超聲功率為1 000 w，頻率為20 000 Hz。回收溶劑后得青錢柳醇提物浸膏，稱取部分浸膏揮干溶劑后進(jìn)行冷凍干燥得青錢柳葉95%乙醇提取物。

1.2.1.3 乙醇提取物不同溶劑萃取物的制備 稱取上述青錢柳葉醇提物浸膏600 g，加適量水懸混，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每種溶劑萃取多次，合并萃取液并減壓濃縮各萃取液，揮干溶劑后進(jìn)行冷凍干燥，分別得到青錢柳葉石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后的水層物樣品。

1.2.1.4 醇提后水提取物的制備 將上述青錢柳葉經(jīng)醇提后的藥渣晾干后，取1 000 g加8～10倍蒸餾水90℃浸提2次，合并浸提液，過濾濃縮后冷凍干燥，得青錢柳葉醇提后的水提物。

青錢柳葉不同提取物的制備工藝流程見圖1。

圖1 青錢柳葉不同提取物的制備工藝流程Figure 1 Preparation of different extracts from C.paliurus leaves

1.2.2 青錢柳葉不同提取物的抗氧化活性測定

1.2.2.1 對DPPH自由基的清除試驗 1,l-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一種有機合成的自由基，DPPH自由基有單電子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm附近有強吸收。在試驗中，當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時，其孤對電子被配對，顏色會由紫色變淺，根據(jù)吸光度的變化可以計算其自由基的清除率。

稱取上述制得的7個青錢柳葉提取物樣品各10 mg，分別置于小燒杯中用甲醇溶解，并于100 mL容量瓶中定容至刻度，得0.10 mg·mL-1不同樣品的儲備液。將濃度為0.10 mg·mL-1的樣品溶液用無水乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.10 mg·mL-1的溶液。分別取3 mL上述溶液于試管中，并加入2 mL 0.2 mmol·mL-1的DPPH溶液，混勻后避光靜置1 h，在517 nm處測定吸光度（用原溶劑作參比）。同時測定3 mL無水乙醇與2 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH溶液的混合溶液在517 nm處的吸光度，以蒸餾水作空白對照，3次重復(fù)。按照公式（1）計算不同濃度待測液的DPPH自由基清除率。以L-抗壞血酸Vc作陽性對照。

式中，Ai為3 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為3 mL樣品溶液+2mL無水乙醇的吸光度；Ac為3 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.2.2 對羥自由基的清除試驗 利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基：H2O2+Fe2+=·OH+H2O+Fe3+在反應(yīng)體系中加入水楊酸，F(xiàn)enton反應(yīng)生成的羥自由基與水楊酸反應(yīng)，生成于510 nm處有特殊吸收的2,3-二羥基苯甲酸。如果向反應(yīng)體系中加入具有清除羥自由基功能的被測物，就會減少生成的羥自由基，從而使有色化合物的生成量相應(yīng)減少。采用固定反應(yīng)時間法，在510 nm處測量含被測物反應(yīng)液的吸光度，并與空白液比較，以測定被測物對羥自由基的清除作用。稱取上述制得的7個青錢柳葉提取物樣品各100 mg，分別置于小燒杯中用甲醇溶解，并于100 mL容量瓶中定容至刻度，得1.0 mg·mL-1不同樣品的儲備液。

將濃度為1 mg·mL-1樣品溶液用無水乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的待測物溶液。根據(jù)表1設(shè)計的試劑和劑量往比色管中添加藥品，依次加入9 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL、9 mmol·L-1L水楊酸乙醇溶液1 mL、樣品溶液1 mL、去離子水1 mL和8.8 mmol·L-1H2O2溶液1 mL。搖勻，在37℃水浴中加熱15 min后取出，于510 nm處測定吸光度。測定Ac時，參比溶液為不加雙氧水體系。Ai、Aj測定時參比溶液為去離子水。以L-抗壞血酸Vc為陽性對照。

表1 各試劑添加量Table 1 Dosage of each reagent

按照公式（2）計算不同濃度待測液對羥自由基的清除率：

式中，Ai為添加樣品溶液的吸光度；Aj為添加去離子水代替雙氧水溶液的吸光度；Ac為不添加樣品溶液的吸光度。

1.2.2.3 對超氧陰離子自由基的清除試驗 在弱堿性條件下，鄰苯三酚不穩(wěn)定，會迅速自氧化釋放出超氧離子，并生成有色的中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物在λ=320 nm處有一特征吸收峰。當(dāng)有抑制劑存在時，抑制劑清除超氧離子而阻止了中間有色物質(zhì)的積累，所以可以通過檢測中間產(chǎn)物的含量來測定清除自由基的能力。

稱取上述制得的7個青錢柳葉提取物樣品各100 mg，分別置于小燒杯中用甲醇溶解，并于100 mL容量瓶中定容至刻度，得1.0 mg·mL-1不同樣品的儲備液。將1 mg·mL-1樣品溶液用70%乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的待測物溶液。

取4.5 mL Tris-HCL 緩沖液（0.05 mol·mL-1pH 8.2）于試管中，在25℃水浴中保溫10 min，加入不同濃度的青錢柳樣品溶液1.0 mL，混勻后加入0.4 mL 6 mmol·L-1鄰苯三酚，反應(yīng)4 min，加入8 mol·L-1HCL 溶液1.0 mL終止反應(yīng)，于320 nm下測量其吸光度。每個濃度重復(fù)3次，取平均值。按照公式（3）計算不同濃度待測液的超氧陰離子自由基清除率。以L-抗壞血酸Vc為陽性對照。

式中，Ac為去離子水代替青錢柳樣品溶液時的吸光度；Ai為青錢柳樣品不同濃度下的吸光度；Aj為去離子水代替鄰苯三酚時青錢柳樣品不同濃度下的吸光度。

1.2.2.4 提取物中總黃酮含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取蘆丁對照品18 mg，溶于70%乙醇并置于100 mL容量瓶定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液（每1 mL含蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.176 4 mg）。分別精確吸取0.176 4 mg·mL-1蘆丁標(biāo)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于6只10 mL具塞試管中，加入1 mL 1%三氯化鋁（甲醇溶液），并加入甲醇至10 mL，搖勻，放置15 min，以蒸餾水為對照，于410 nm處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：稱取上述制得的各提取物樣品各50 mg，用70%乙醇溶解后定容至25 mL，搖勻。吸取0.5 mL樣品液于10 mL具塞試管中，加入1 mL 1%三氯化鋁（甲醇溶液），用甲醇定容，搖勻，放置15 min，以蒸餾水為對照，于410 nm處測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣液中總黃酮的含量。總黃酮含量（M）計算公式如下：

式中，ρ表示樣液中黃酮濃度（mg·mL-1），由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出；V表示樣液體積的放大倍數(shù)；m表示稱取樣品的質(zhì)量（mg）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel表進(jìn)行繪圖；采用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行Pearson’s相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳葉不同提取物對DPPH自由基的清除作用

由圖2可知，7個樣品中除石油醚萃取物對DPPH自由基的清除作用較弱外，其他6個樣品均表現(xiàn)出對DPPH自由基有較強的清除能力，且清除率隨濃度的升高而增大；在0.04 mg·mL-1濃度以下時，其清除率與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（見表2），而當(dāng)濃度超過0.04 mg·mL-1后，其清除率基本保持在一個穩(wěn)定狀態(tài)；清除率最大的為醇提后的水提物，當(dāng)濃度為0.1 mg·mL-1時其清除率達(dá)到91.29%。Vc對DPPH自由基的清除率在0.01～0.1 mg·mL-1濃度范圍時均達(dá)到90%以上，各提取物在低濃度下對DPPH自由基的清除能力都弱于Vc；而當(dāng)濃度超過0.04 mg·mL-1后，除石油醚萃取物外其余樣品對DPPH自由基的清除率基本與Vc接近。

圖2 青錢柳葉不同提取物對DPPH自由基的清除作用Figure 2 Scavenging effect on DPPH by different extracts from C.paliurus leaves

表2 不同樣品的濃度與DPPH自由基清除率的線性關(guān)系及其IC50值Table 2 Linear relationship between concentration of extracts and DPPH scavenging rate and IC50

根據(jù)不同提取物對DPPH自由基的清除率與濃度的關(guān)系（0～0.04 mg·mL-1濃度范圍），得到各自的線性方程，由線性方程計算出各樣品的IC50值（清除率為50%時所需樣品的濃度），且達(dá)到半數(shù)清除率時所需樣品濃度越低，說明樣品的抗氧化性越強。由表2可知，各提取物對DPPH自由基的清除能力的強弱依次為：醇提后的水提物＞正丁醇萃取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯萃取物＞水層物＞水提物＞石油醚萃取物。

2.2 青錢柳葉不同提取物對羥自由基的清除作用

由圖3可知，在試驗所選的濃度范圍內(nèi)Vc對羥自由基的清除率與濃度大小成正比，當(dāng)濃度為1 mg·mL-1時其清除率達(dá)到93.88%，且濃度與清除率呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，y=102.30x－9.053（R2=0.992 0），根據(jù)此線性關(guān)系計算得出Vc的IC50值為0.58 mg·mL-1。而所有樣品對羥自由基的清除率隨濃度的增大變化并不明顯，呈現(xiàn)出一個極度緩慢的變化趨勢。從各樣品對羥自由基的清除能力來看，除乙醇提取物、正丁醇萃取物和水提物在低濃度下清除率大于Vc外，其他樣品的清除率都遠(yuǎn)小于Vc，特別是水層物，在濃度為1 mg·mL-1以下對羥自由基的清除率均為負(fù)值，當(dāng)試驗濃度提高到2 mg·mL-1以上時才表現(xiàn)為正值。對羥自由基清除率最大的為乙醇提取物，當(dāng)濃度為1 mg·mL-1時清除率為53.55%。

圖3 青錢柳葉不同提取物對羥自由基的清除作用Figure 3 Scavenging effect on hydroxyl radical by different extracts from C.paliurus leaves

根據(jù)表3各樣品對羥自由基的清除率與濃度的關(guān)系可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)除石油醚提取物外，其余樣品的線性關(guān)系良好，由線性方程計算出各樣品的IC50值，根據(jù)IC50值比較各樣品對羥自由基的清除能力從大到小依次為：乙醇提取物＞正丁醇提取物＞水提物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞醇提后的水提取物＞水層物。

表3 樣品濃度與羥自由基清除率的線性關(guān)系及IC50值Table 3 Linear relationship between concentration of extracts and hydroxyl radical scavenging rate and IC50 value

2.3 青錢柳葉不同提取物對超氧陰離子自由基的清除作用

不同樣品對超氧陰離子自由基的清除作用見圖4。由圖4可知，Vc對超氧陰離子自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，且當(dāng)濃度為1 mg·mL-1時其清除率達(dá)到96.21%，在0.4 mg·mL-1濃度以下可擬合線性關(guān)系為y=231.7x－16.12（R2=1），根據(jù)此線性關(guān)系計算得出Vc的IC50值為0.29 mg·mL-1；各樣品對超氧陰離子自由基的清除率都明顯小于Vc，且隨著濃度的增大其變化幅度較小，各樣品在該濃度范圍內(nèi)對超氧陰離子自由基的清除能力比較接近。當(dāng)濃度為1 mg·mL-1時，其清除率從大到小依次是：正丁醇萃取物為20.1%、乙酸乙酯萃取物為19.77%、乙醇提取物為18.72%、石油醚萃取物為17.8%、水層物為12.69%、醇提后的水提物為12.23%、水提物為10.7%。

圖4 青錢柳葉不同提取物對超氧陰離子自由基的清除作用Figure 4 Scavenging effect on superoxide anion free radical by different extracts from C.paliurus leaves

2.4 青錢柳葉不同提取物中的總黃酮含量及其與抗氧化活性的相關(guān)性

通過對青錢柳葉各提取物中總黃酮含量的測定結(jié)果表明（表4），總黃酮含量最高的為醇提后的水提物，含量達(dá)11.32%，其次為水提物，為10.94%，二者的總黃酮含量均顯著高于其他幾種樣品的（P＜ 0.01），乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和乙醇提取物中的黃?含量雖較前兩者低，但含量均在6%以上，而石油醚萃取物和水提物中的總黃酮含量很低，幾乎為零。通過對樣品中的總黃酮含量與DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率之間的相關(guān)性分析表明（見表5），總黃酮含量與DPPH自由基清除率呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.602，P=0.000（P＜ 0.01）；總黃酮含量與羥自由基清除率呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.427，P=0.011（P＜ 0.05）；總黃酮含量與超氧陰離子自由基清除率呈正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著，r=0.210，P=0.225。

表4 青錢柳葉不同提取物中的總黃酮含量Table 4 Content of total flavonoids in different extracts of C.paliurus leaves

表5 青錢柳葉提取物總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 5 Correlation between total flavonoids of extracts from C.paliurus leaves and antioxidant activity

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

由于天然產(chǎn)物的組成成分及結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，為了篩選有效的活性組分，需采用現(xiàn)代分離和分析技術(shù)對各組分和單體進(jìn)行深入研究[17]，其中利用不同溶劑將性質(zhì)相近的組分集中在一起將其提取出來，并分別與臨床、動物實驗相配合，確定該部分是否有效，再對有效部分進(jìn)行分離、找出關(guān)鍵成分的系統(tǒng)分離法是應(yīng)用較為普遍的一種技術(shù)手段。本試驗利用溶劑的極性大小對青錢柳葉中的有機成分進(jìn)行粗分，得到成分相似的不同組分，并考察各組分的抗氧化活性及抗氧化活性與活性組分間的量效關(guān)系。水作為強極性溶劑常用于提取極性很大的甙類、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、小分子有機酸等；乙醇作為親水性有機溶劑，除了蛋白質(zhì)、黏液、果膠、淀粉和部分多糖外，其他極性成分大部分能溶解，為了能夠提取出一些極性較大的甙類物質(zhì)，通常采用95%乙醇；石油醚作用親脂性的有機溶劑，常用于提取揮發(fā)油、脂肪油、脂溶性色素等非極性有機成分；乙酸乙酯和正丁醇作為中等和中等偏大極性的有機溶劑常用于提取中等極性的黃酮甙類和中等偏大極性的某些甙類（如皂甙、蒽酮甙等）。黃酮類化合物的多酚結(jié)構(gòu)，可提供活潑的質(zhì)子，與自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，從而起到清除自由基的作用，黃酮類化合物的提取分離常用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或某些極性較大的混合溶劑如甲醇-水等進(jìn)行萃取[18]。

3.2 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，青錢柳葉各提取物對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基都有不同程度的清除作用，但各提取物對不同自由基的清除能力存在一定的差異。青錢柳葉各提取物對DPPH自由基具有較強的清除作用，在0.04 mg·mL-1濃度以下，其清除率與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，清除率最大的為醇提后的水提物；當(dāng)濃度為0.1 mg·mL-1時，其清除率達(dá)到91.29%；各提取物對DPPH自由基的清除能力依次為：醇提后的水提物＞正丁醇萃取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯萃取物＞水層物＞水提物＞石油醚萃取物。對羥自由基的清除能力最強的為乙醇提取物，當(dāng)濃度為1 mg·mL-1時其清除率為53.55%；在試驗濃度范圍內(nèi)除石油醚提取物外，其余樣品的濃度與清除率均呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。各樣品對超氧陰離子自由基的清除率都明顯小于Vc，且隨濃度的增大其變化幅度較小。

試驗結(jié)果表明，采用乙醇、水和正丁醇等極性溶劑提取得到的活性組分的抗氧化作用強于其他提取物的活性組分，說明青錢柳葉中發(fā)揮抗氧化作用的是極性偏大的物質(zhì)。同時，分析表明，總黃酮含量最高的為醇提后的水提物，其次為水提物，二者均顯著高于其他幾種樣品，且各提取物中的總黃酮含量與DPPH自由基清除率、羥自由基清除率均呈極顯著（P＜0.01）和顯著正相關(guān)（P＜0.05），與超氧陰離子自由基清除率呈正相關(guān)，說明黃酮類化合物可能是青錢柳葉中主要的抗氧化活性成分之一。這與董彩軍[11]、陳瑋玲[12]等的研究結(jié)果相一致。許多研究證實黃酮類化合物是一種很強的活性氧自由基清除劑，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[19-20]。至于青錢柳葉中抗氧化活性的強弱取決于黃酮類化合物中的哪種結(jié)構(gòu)成分還有待進(jìn)一步研究。