外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗生理效應的影響

趙 英， 張佳佳， 吳 敏， 鄧 平， 朱宇林*， 黃司翊

（1.玉林師范學院 生物與制藥學院，廣西 玉林537000； 2.西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌712100）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科多年生藤本植物的果實，原產我國廣西、廣東、江西等省的熱帶、亞熱帶山區，是衛生部首批公布的藥食兩用的名貴中藥材，富含羅漢果甜苷、多種氨基酸和維生素等［1］.常飲羅漢果茶，可預防多種疾病，現代醫學證明，羅漢果對支氣管炎、高血壓等疾病有顯著療效，還能起到防治冠心病、血管硬化、肥胖癥的作用.目前，廣西擁有大面積的羅漢果種植基地，羅漢果也是當地農業經濟收入的主要來源.

土壤鹽堿化是影響全球農林業生產、發展和生態環境的重大問題，也是影響我國廣西地區農林生產的主要因素之一，同時灌溉農業的發展和化肥使用不當等原因造成的次生鹽漬土壤面積擴大，也嚴重限制了廣西地區羅漢果種植產業的發展.鹽脅迫會抑制植物生長，使農作物產量受到不同程度的影響.因此，提高植物的抗鹽性，減少鹽脅迫對于農作物的影響是人們普遍關注的話題.鈣是植物所必需的營養元素，對維持細胞膜透性、離子運輸、信號傳導、調控酶活性等有重要作用，研究［2-5］發現Ca2＋參與多種逆境脅迫過程，如鹽脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、氧脅迫等，可提高植物對逆境的適應能力.當植物受到外界脅迫時，細胞內Ca2＋濃度升高，可與鈣調蛋白質結合成激活態復合體，激活基因表達，啟動一系列反應使植物適應脅迫環境.華智銳等［6］研究發現施加適量濃度的外源鈣能顯著抑制鹽脅迫下黃芩幼苗MDA的積累；周紅菊［7］發現鹽脅迫能明顯降解葉綠素含量，外源鈣能有效緩解鹽脅迫對玉米幼苗葉綠素含量的影響；嚴蓓等［8］指出外源噴施Ca2＋可提高黃瓜幼苗的鹽脅迫耐性；楊莎等［9］在研究外源鈣對鹽脅迫下花生幼苗的影響時，發現施加外源鈣可以誘導花生幼苗抗氧化酶系統（CAT、POD和SOD）酶活性升高，祛除因鹽脅迫造成積累的活性氧，降低活性氧對花生幼苗的破壞程度.然而，鈣對植物鹽脅迫的緩解效果因鈣鹽種類、濃度、不同植物種類等而不同，目前外源鈣能否緩解鹽脅迫對羅漢果幼苗的傷害及其適宜濃度，還未見相關報道.因此，本文擬研究不同濃度的外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗生理特性的影響，以期為羅漢果幼苗的鹽漬栽培及品質提高提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料本實驗于2019年4月15日上午9：00選用長勢一致，株高為30 cm左右的一年生羅漢果幼苗，栽培在內徑為20 cm，高為15 cm的普通花盆內，置于玉林師范學院農學院玻璃溫室大棚，棚內晝夜溫度分別為28和20℃，白天光強為1 200 μmol／（m2·s），相對濕度保持在60%±2.5%.培養土選用V（園土）∶V（基質）∶V（有機肥）＝1∶1∶1比例混合混勻，盆內土高12 cm，每個盆種植羅漢果幼苗1株，種植后土面上散上一層木屑起保水作用，在每株幼苗旁插上長120 cm的竹條，供幼苗攀爬.緩苗3周后開始鹽脅迫試驗.為保證幼苗健康生長，緩苗期土壤含水量為（25.4±1.23）%.

1.2 實驗設計前期實驗研究表明，羅漢果耐鹽性較弱，120 mmol／L的NaCl濃度會對羅漢果幼苗造成顯著影響，大于120 mmol／L的NaCl濃度甚至會造成幼苗死亡，本試驗選擇臨界NaCl濃度120 mmol／L進行.試驗于2019年5月11日在廣西玉林師范學院玻璃溫室大棚中進行，本試驗采用完全隨機試驗，CaCl2濃度梯度分別為0、2、6、10、14和18 mmol／L（T1、T2、T3、T4、T5、T6），其中T1～T6為鹽脅迫（NaCl）組，且鹽脅迫濃度為120 mmol／L，以自來水處理為對照（CK），共計設置7個處理.脅迫處理14 d后，選擇長勢一致的幼苗，取植株中部生長一致的葉片，每個處理隨機選取3株進行重復測定.具體試驗處理見表1.

表1 試驗處理設計Tab.1 Test processing design

1.3 實驗方法參照葉寶興［10］的測定方法，丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法.參照胡炳義等［11］的測定方法，可溶性蛋白含量的測定采用紫外吸收法測定.參照張志良［12］的方法，葉綠素（Chl）含量的測定采用丙酮提取法；脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定；過氧化氫酶（CAT）活性的測定，采用紫外吸收法；過氧化物酶（POD）活性的測定，采用愈創木酚法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定，采用用氮藍四唑（NBT）光還原法.

1.4 數據統計與分析采用Excel 2007進行圖表制作，運用統計分析軟件SPSS 17.0對試驗數據進行顯著性檢驗，以P＜0.05為顯著性標準.采用隸屬函數值評價施加外源鈣對羅漢果幼苗耐鹽性的影響，若所測指標與羅漢果幼苗耐鹽性呈正向關系，則隸屬函數值計算公式為

若某一指標與鹽脅迫耐性呈反向關系，可通過反隸屬函數計算其隸屬函數值

其中，U為某一處理下的某一指標的隸屬值，X為某一處理生理生化指標參數的測定值，Xmin為該指標測定值中的最小值，Xmax為測定值中的最大值［13］.

2 結果與分析

2.1 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗MDA含量的影響MDA是植物細胞膜質過氧化的產物之一，MDA含量不僅可以反映出組織內脂質過氧化的程度，還能間接反映植物細胞受損傷的程度［14］，在一定鹽脅迫范圍內可以作為鑒定植物耐鹽性的生理指標［15］.由圖1可知，濃度為120 mmol／L的鹽脅迫下，羅漢果幼苗MDA含量顯著升高（P＜0.05），施入不同濃度的外源Ca2＋均能顯著降低羅漢果幼苗MDA的含量（P＜0.05），且隨著外源鈣濃度的提高，羅漢果幼苗MDA含量先降低后升高，當Ca2＋濃度為6 mmol／L時，MDA含量最低，與T1相比羅漢果幼苗MDA含量下降了45.53%，但仍顯著高于CK（P＜0.05）；當外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，羅漢果幼苗丙二醛含量顯著增加，但仍小于T1中MDA的含量，說明不同濃度的外源鈣能夠緩解120 mmol／L濃度的鹽脅迫對羅漢果幼苗的傷害，但存在一定差異.

圖1 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗MDA含量的影響Fig.1 Effect of CaCl 2 concentration on malondialdehyde content of siraitia grosvenorii seedlings undersalt stress

2.2 CaCl2對鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白的影響由圖2可知，當受到鹽脅迫時，羅漢果幼苗葉片可溶性蛋白含量顯著增加（P＜0.05）.

圖2 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of CaCl 2 concentration on soluble protein content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

不同濃度的外源Ca2＋均可增加葉片可溶性蛋白含量，但增幅不同.隨著外源Ca2＋濃度的增加，可溶性蛋白呈現出先增加后減小的趨勢.

當Ca2＋濃度在6 mmol／L時，可溶性蛋白含量達到最大值（P＜0.05），與T1相比增幅達76.68%；當Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，可溶性蛋白含量減小，但仍顯著高于T1可溶性蛋白含量（P＜0.05），這可能是由于羅漢果幼苗在受到鹽脅迫時，為適應生長環境而在體內合成了某種蛋白酶，以應對逆境下的不良影響.一定濃度的外源Ca2＋可以有效提高對鹽脅迫下的羅漢果幼苗可溶性蛋白含量，降低滲透勢，增大膨壓，提高羅漢果幼苗抵御外界鹽脅迫的能力，但當外源Ca2＋濃度大于10 mmol／L時，可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），這可能是由于植物組織細胞內鈣離子累積量過高，打破了細胞內的滲透調劑物質的平衡狀態，從而抑制可溶性蛋白增加，說明不同植物種類對外源鈣耐受力與生理反應不相同.濃度為6～10 mmol／L的CaCl2能顯著增加濃度為120 mmol／L的鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白的含量.

華智銳等［16］研究外源Ca2＋對鹽脅迫下商洛丹參的影響，發現一定濃度的外源Ca2＋會使鹽脅迫下丹參幼苗可溶性蛋白含量增加，這與本文研究結果一致.

2.3 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗脯氨酸含量的影響脯氨酸作為重要的滲透調節物質，在維持植物體原生質穩定性上起著至關重要的作用.脯氨酸還可通過改善一些抗氧化酶活性、光合活性和植物生長，來增強植物的耐鹽性［17-18］.如圖3所示，羅漢果幼苗在120 mmol／L鹽脅迫下，脯氨酸含量顯著增加（P＜0.05）.

圖3 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of CaCl 2 concentration on proline content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

施入外源Ca2＋后，羅漢果幼苗脯氨酸含量隨著Ca2＋濃度升高呈先升后降的趨勢，且均顯著高于CK和T1（P＜0.05）.外源Ca2＋濃度為6 mmol／L時，脯氨酸含量達到最大值，與T1相比增加了148.69%（P＜0.05）；外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，羅漢果幼苗脯氨酸含量下降，與T1相比分別增加了124.92%、117.29%和112.67%.可見不同濃度的外源鈣能夠提高羅漢果幼苗脯氨酸的含量.

2.4 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗葉綠素含量的影響葉片是植物進行光合作用的主要器官，葉綠素含量是影響植物光合作用的重要因素，葉綠素含量的高低在一定程度上反映植物進行光合作用的水平［19］.

由圖4可以看出，120 mmol／L鹽脅迫處理下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b含量均顯著降低（P＜0.05）；隨著外源Ca2＋濃度的增加，Chl a、Chl b含量呈現先增加后減小的趨勢；當外源Ca2＋濃度為6 mmol／L，Chl a、Chl b含量達到最大值，與T1相比分別增加了73.71%和31.36%；當外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時，Chl a、Chl b含量逐漸減少，T6處理下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b含量最少.同時，120 mmol／L鹽脅迫處理后羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均顯著低于CK（P＜0.05）.隨外源Ca2＋濃度增加羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b呈先升高后降低，經方差分析T1～T4處理，其中T3處理后，羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b甚至超過對照CK，分別增加了6.42%和20.29%.T6處理下羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均達到最低.

圖4 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of CaCl 2 concentration on chlorophyll content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.5 CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗葉片CAT、SOD和POD活性的影響由圖5可知，與CK相比，120 mmol／L鹽脅迫處理下，羅漢果幼苗POD、CAT活性顯著增強，SOD活性顯著降低（P＜0.05）.外源施加不同濃度Ca2＋，均能提高3種保護酶活性.隨著外源Ca2＋濃度的增加，SOD、POD、CAT活性均先增強后減弱；不同濃度的外源Ca2＋均能顯著提高120 mmol／L鹽脅迫下羅漢果幼苗SOD和CAT活性；T2、T3處理下，羅漢果幼苗SOD、POD和CAT活性均隨著Ca2＋濃度升高而升高，當Ca2＋濃度為6 mmol／L時，羅漢果幼苗體內SOD、POD和CAT活性達到最大，與T1相比增加顯著（P＜0.05），分別增加83.53%、21.11%和78.81%；當Ca2＋大于6 mmol／L時，羅漢果幼苗SOD、POD活性顯著降低（P＜0.05），CAT活性降低.T6處理下，羅漢果幼苗SOD、POD和CAT活性最低.

圖5 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of CaCl 2concentration on SOD，POD，CAT activity of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.6 不同濃度外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗各指標的隸屬度分析隸屬函數值可分為4個等級，其等級代表植物適應環境的不同程度：不抗型（隸屬值 ＜0.2）、弱抗型（0.2≤隸屬值≤0.4）、中抗型（0.4≤隸屬值≤0.6）、高抗型（0.6≤隸屬值≤1）［20］.將外源鈣對鹽脅迫下羅漢果幼苗測定的10個指標生理指標參數的隸屬函數計算加權平均值，綜合評價外源鈣對羅漢果耐鹽性的影響，如表2所示.在CK～T6處理下，不同濃度CaCl2處理羅漢果幼苗的耐鹽性綜合排名

表2 不同濃度CaCl 2對鹽脅迫下羅漢果幼苗各指標的隸屬度分析Tab.2 Analysis of the subordinate degree of different concentrations of CaCl 2 on the indexes of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

可見T1和T6處理屬于弱抗型，T2、T5屬于中抗型，CK、T3和T4屬于高抗型.因此，緩解羅漢果幼苗鹽脅迫最好的外源鈣濃度為6 mmol／L.

3 結論與討論

植物遭到鹽脅迫時，活性氧代謝平衡被破壞，活性氧積累，自由基增加，生理指標發生不同程度的變化.文獻［21］研究表明，Ca2＋是植物生長所必須的大量元素，是偶聯胞外信號和胞內生理反應的第二信使，在調節植物細胞對逆境適應性過程中發揮著重要作用.Ca2＋可增加質膜的穩定性和鈣信號系統的正常發生和傳遞，以維持細胞內離子平衡，降低質膜透性，組織胞內鉀離子的外滲和鈉離子的進入.MDA作為膜脂過氧化的主要產物，直接關系到植物細胞膜受損程度.本試驗中鹽脅迫處理下羅漢果幼苗葉片MDA含量升高，表明鹽脅迫加強了植物細胞膜脂過氧化程度；施入不同濃度的外源鈣后，MDA含量呈現先升后降的趨勢，說明一定濃度的外源Ca2＋達到6 mmol／L時能夠有效緩解鹽脅迫對羅漢果幼苗的傷害，利于植物器官壽命的延長［22］.但當外源鈣濃度過高時，這種緩解作用就被抑制，這與鄭秀芳等［23］對馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）的研究相一致.

可溶性蛋白、脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質，這些物質含量的積累有利于植物耐鹽性提高［22］.鹽脅迫下，羅漢果幼苗通過提高自身滲透調節物質緩解鹽脅迫帶來的傷害，加入外源Ca2＋后受顯著增強了羅漢果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量.當外源Ca2＋濃度為6 mmol／L時，羅漢果幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量最高；說明適宜濃度的外源Ca2＋可以有效提高羅漢果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量，羅漢果幼苗通過提高自身滲透調節物質抵御鹽脅迫帶來的傷害.

葉綠素含量在一定程度上反映植物同化物質能力的強弱［24］.鹽脅迫對羅漢果幼苗葉綠素含量影響顯著，鹽脅迫下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均顯著下降，這可能是由于鹽脅迫下葉綠體中的光系統Ⅱ（PSⅡ）的光能捕獲和用于電子傳遞的量子產額，從而影響了植物的光合性能［25］.導致鹽脅迫下葉綠素含量會降低，施入不同濃度外源Ca2＋后，羅漢果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b先增加后降低.當外源Ca2＋為6 mmol／L時，Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均達到最大值，這可能是因為一定濃度的外源Ca2＋能顯著增強植物葉片抗氧化酶活性，清除活性氧，大大緩解葉綠素含量的分解，增強植物葉片對鹽脅迫的適應性，提高植物葉片利用光的能力，這與劉麗等［26］研究結果一致.

鹽脅迫下，SOD、POD、CAT作為植物抗氧化物保護酶，能夠清楚自身多余的活性氧及自由基［27］.本文中羅漢果幼苗在120 mmol／L鹽脅迫時，SOD活性減弱，POD、CAT活性增強，加入不同濃度的外源Ca2＋后，SOD和CAT活性均顯著增強.POD除在T2處理后活性降低外，其余活性均顯著增加，說明外源Ca2＋能有效提高羅漢果幼苗抗氧化酶活性，這與劉藝平等［28］的研究結果一致.當外源Ca2＋達到6 mmol／L時，SOD、POD、CAT活性均達到最高，說明濃度為6 mmol／L的外源Ca2＋能顯著提高鹽脅迫下羅漢果幼苗抗氧化酶活性.

經隸屬函數綜合分析表明，不同濃度CaCl2處理羅漢果幼苗的耐鹽性綜合排名為

可見，T1、T6處理屬于弱抗型，T5、T2屬于中抗型，T4、CK和T3屬于高抗型.因此，外源鈣濃度為6～10 mmol／L能顯著緩解羅漢果幼苗鹽脅迫，濃度為6 mmol／L效果最佳.