蛋殼形成與卵鈣蛋白-32的研究進展

農燕鴻　任宇　郭愛偉　李青青　吳培福　楊亞晉　陳粉粉　劉莉莉

摘要：蛋殼是由無細胞子宮液中碳酸鈣和有機基質沉積而成的高度有序的結構。雞的蛋殼由3層組成，由內向外分別是蛋白質殼膜、鈣化層和角質層。鈣化層提供了堅硬的保護殼，角質層不僅在調節水和氣體交換方面發揮重要作用，還含有多種抗菌蛋白。卵鈣蛋白-32（Ovocalyxin-32，OCX-32）是由子宮或輸卵管上皮細胞分泌的一類特異性基質蛋白，主要分布在蛋殼的角質層，它通過終止鈣化和抗菌保護在蛋殼形成過程中起著不可或缺的作用。文章綜述了蛋殼形成過程和OCX-32在禽蛋中的來源、分布以及生物學功能等，以期為后續該蛋白質的相關研究提供參考和新的思路。

關鍵詞：蛋殼形成;OCX-32;鈣化;抗菌保護

中圖分類號：S831.1? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2021）04-0020-04

蛋殼質量是商品蛋生產的重要特征。盡管在整個產蛋周期中產蛋的總數很重要，但每個蛋在結構上也必須牢固，且能夠承受物理和微生物的挑戰。家禽的蛋殼被認為是一種鈣質的生物陶瓷，由于其高度復雜有序的多孔多晶結構，使自身具有獨特的力學性能，不僅可以在一定程度上保護發育中的胚胎免受物理沖擊，還可以調節水、氧氣和二氧化碳在外部環境和胚胎間的擴散交流，是胚胎發育和生存必不可少的物質基礎[1]。研究表明，蛋殼的這種多孔多晶結構與蛋殼基質蛋白有著密不可分的關系[2]。卵鈣蛋白-32（Ovocalyxin-32，OCX-32）是蛋殼鈣化過程中所特有的基質蛋白，可通過終止蛋殼鈣化和抗菌防御等生理功能影響蛋殼的形成和胚胎的發育[3]。基于此，本文分析了蛋殼形成過程及OCX-32在禽蛋中的來源、分布及其生物學功能，為后期的深入研究奠定了基礎。

1 蛋殼的形成概述

1.1 蛋殼的結構

蛋殼是在家禽子宮部形成的一種高度復雜有序的鈣化結構，由約94%～97%的無機物和約3%～6%的有機物組成[4-5]。從分子水平來看，蛋殼可分為3層：非鈣化層，為富含有機成分的內、外殼膜，殼膜中含有約10%的膠原蛋白（I型、V型和X型）和70%～75%的蛋白多糖;鈣化層，為碳酸鈣以方解石晶體形式沉淀形成的乳突層、柵欄層和垂直晶體層，含有約95%碳酸鈣、3.5%有機基質蛋白以及鎂、磷等各種微量元素;角質層，為處于蛋殼最外層的膠護膜，富含羥基磷灰石和多種抗菌蛋白[5-7]。

1.2 蛋殼的形成

禽蛋是在卵子從卵巢釋放后沿著輸卵管移動的過程中形成的，主要由蛋白、蛋殼膜、鈣化蛋殼和角質層包圍的中央蛋黃組成[8]。排卵后，卵子分別在輸卵管漏斗部和膨大部合成卵黃質外膜和蛋白[7]，然后，蛋黃/蛋白復合體依次穿過輸卵管的峽部和子宮部，完成蛋殼鈣化。

鈣化是雞蛋形成過程中耗時最長的階段，可分為三個不同的階段：初始階段、快速增長階段和終止階段[9]。蛋殼沉積的初始階段又可分為3個小階段，即殼膜、成核位點和乳突層的先后形成[8]。首先，輸卵管近端（白色峽部）的上皮細胞分泌殼膜的各種前體蛋白（約90%）、脂質體（約3%）和少量的糖類（約2%）以構成蛋白多糖，蛋白多糖與角蛋白、膠原蛋白共同形成纖維結構蛋白并交織成網狀纖維，多層纖維網再組織構成形態不同的內、外殼膜，成為方解石晶體沉積的結構基礎。然后，發育中的蛋移動到輸卵管遠端（紅色峽部），由腺體細胞分泌的卵磷脂17（Ovocleidin-17，OC-17）通過自身精氨酸殘基與方解石晶體表面的鈍角臺階緊密結合，進而促進多個方解石晶體在外殼膜上不連續的位置上聚集形成近似球狀的有機聚合體，即成核位點[10-12];接下來，由上皮細胞分泌的卵磷脂-116（Ovocleidin-116，OC-116）發生糖基化，它與腺體細胞分泌的一種糖胺聚糖——硫酸角質素（Keratan sulphate，KS）共價結合形成以OC-116為核心蛋白的蛋白多糖，由于KS自身攜帶的硫酸基含有大量的陰離子，因此通過電離效應就可吸附鈣離子到成核位點，促進方解石成核并迅速向外生長，最終到達柵欄層基部，形成富含蛋白多糖的乳頭狀突起，即乳突層，整個初始階段持續約6 h[13]。在快速生長階段，子宮液中的硫酸皮膚素（Dermatan sulphate，DS）和硫酸軟骨素（Chondroitin sulphate，CS）同時與OC-116發生糖基化，并生成含有2種糖胺聚糖的蛋白多糖，其中CS含量較多，DS含量較少，大量的陰離子導致鈣離子聚集，方解石晶體以平均沉積速率為0.33 g/h的速度進行線性沉積，該階段持續約10 h[7，14]。乳突層和柵欄層的超微結構可以用晶體生長競爭模型來粗略解釋，即方解石聚集形成成核位點時，位點最初為可以向所有方向生長的狀態，當生長到一定程度時，由于相鄰生長位點之間的空間競爭，只有垂直于卵黃表面生長的晶體才有空間生長，因次乳突層整體呈圓錐體狀，柵欄層呈現垂直于蛋殼表面的柱狀物形態[7]。柱狀晶體生長一直持續到沉積了一層薄的垂直晶體層，該垂直晶體層具有比柵欄層更高密度的晶體結構。當鈣化進行到最后階段時，輸卵管上皮細胞分泌大量的OCX-32使方解石停止生長，雞蛋表面形成一層約0.5～12.8 μm的角質層，角質層通過覆蓋外殼并填充其孔的入口，產生一個屏障，阻止水在蛋殼上的運動，并防止蛋內部脫水，該過程持續約1.5 h[15]。

1.3 基質成分對鈣化的調節

鈣化發生在一種無細胞子宮液中，其中含有可溶的基質前體和過飽和的鈣和碳酸氫根離子，方解石晶體與蛋殼基質蛋白在該環境中相互作用并自發沉淀[14]。目前，在雞身上鑒定出的蛋白數量已經從50種增加到1 300種左右，其中在蛋殼中被鑒定出來的有約900種[15]，這些蛋白質可分為3個特征組：①蛋清蛋白，也存在于蛋殼中，包括卵清蛋白、溶菌酶和卵轉鐵蛋白;②普遍存在的蛋白質，例如骨橋蛋白（一種存在于骨骼和其他硬組織中的磷酸化糖蛋白）和簇蛋白（一種分布廣泛的分泌性糖蛋白）;③蛋殼鈣化過程所特有的基質蛋白，是由輸卵管特定區域中的細胞分泌的，包括Ovocleidins和Ovocalyxins兩大類[17]。Ovocleidins主要包括OC-17、OC-116;Ovocalyxin主要包括Ovocalyxin-21（OCX-21）、Ovocalyxin-25（OCX-25）、OCX-32和Ovocalyxin-36（OCX-36）[17，18]。這些有機成分的數量及其在子宮液中的濃度隨蛋殼沉積的不同階段而變化。在每個階段中，特定的有機成分在輸卵管的特定時間和位置分泌，并沉積在蛋殼的不同結構區域形成完整蛋殼[19]。

研究發現，蛋殼基質蛋白可通過3條途徑影響蛋殼的形成：①作為核心蛋白與糖胺聚糖結合形成蛋白多糖，影響方解石的形態，如OC-116作為蛋殼硫酸皮膚素蛋白聚糖（116 kDa和180 kDa）的核心蛋白，廣泛分布在鈣化蛋殼的柵欄層中，影響柵欄層的沉積[5];②通過蛋白磷酸化影響蛋殼結構的強度和形狀，主要的磷酸化蛋白有OC-17、OC-116和OCX-32等，它們以磷酸化依賴性方式調節晶體的成核和生長，在碳酸鈣（方解石）或磷酸鈣（磷灰石）的形成中起著積極的作用[5];③依賴與免疫有關的特性影響蛋殼品質，如溶菌酶、卵清蛋白、卵轉鐵蛋白、OCX-32、OCX-36等在蛋殼形成的起始和末期發揮鈣化和抗菌的雙重作用[5，20]。

2 OCX-32的概述和作用機制

2.1 OCX-32的概述

OCX-32是一種由管腔上皮細胞分泌的32 ku的特異性基質蛋白，集中分布在蛋殼的外部鈣化區域和角質層中[21，22]。

2.2 終止鈣化

Gautron等[2]通過蛋白質印跡法發現OCX-32既不存在于血漿中，也不存在于負責蛋清蛋白產生和分泌的近端輸卵管，而存在于子宮和遠端輸卵管（峽部），表明其并非由其他組織分泌后通過血液傳輸到子宮液中，而是在蛋殼鈣化過程中由子宮細胞分泌。蛋殼發生鈣化時，不同階段子宮液中OCX-32的表達量隨著鈣化的進行逐步增多[23]。在鈣化終止階段，能明顯地探測到子宮液中含有高水平的OCX-32[24]，但是，目前的研究還不能完全解釋OCX-32參與鈣化終止的具體機制[25]，本文將從OCX-32和方解石的特性推測可能存在的終止機制。

Hernández-hernández等[9]的體外碳酸鈣沉淀試驗顯示子宮液和純化的蛋殼提取物中存在的OCX-32對方解石表面具有很強的親和力，并且在控制方解石晶體的生長或聚集中具有積極的作用。隨后的研究證實了這一點，用蛋白酶K緩沖液處理的方解石晶體顯示出孔洞，表明先前存在被吸附的蛋白質[26]。子宮液特定環境條件中OCX-32與方解石之間的靜電相互作用，或是OCX-32蛋白中特定官能團（即-COOH）排列與特定方解石中碳酸鹽或鈣離子排列之間的立體化學匹配，都可使OCX-32對方解石表面具有很強的親和力，進而被選擇性地從溶液中吸附到方解石表面[27]。在鈣化終止末期，子宮液中大量的OCX-32被優先吸附在方解石晶面上，使子宮液中的鈣離子未能在方解石晶面上繼續沉淀，OCX-32與鈣離子之間的競爭關系有效地抑制了方解石的自發沉淀和晶體生長，表現出方解石生長速度減緩的現象，從而實現鈣化終止[28]。

此外，還推測鈣化終止與OCX-32是一種磷酸化蛋白有關[16]。在蛋殼磷蛋白鑒定的研究中，通過發生埃德曼降解反應（Edmandegradation）衍生的序列確定了OCX-32在位置257和268之間的絲氨酸和蘇氨酸上被磷酸化[29]，而磷酸鹽與方解石之間可通過吸附、共沉淀作用生成鈣磷化合物沉淀[30]，因此，大量的OCX-32與方解石發生沉淀反應導致鈣化終止。

2.3 抗菌防護

研究表明，OCX-32蛋白與兩種不相關的哺乳動物蛋白（羧肽酶抑制劑Latexin和維甲酸受體應答器RARRES1）具有一定的同源性（約30%）[26]。Latexin是羧肽酶A活性的抑制劑，在大鼠大腦皮層和肥大細胞中表達，因其在巨噬細胞中高水平表達，并與其他蛋白酶抑制劑和潛在蛋白酶靶點一起被誘導，所以在炎癥中起著重要的作用[31]。RARRES 1最初是從人類皮膚中分離出來，與維甲酸協同可用于治療銀屑病和抑制腫瘤[32，33]。OCX-32、latexin和RARRES 1的排列蛋白序列之間存在相應的外顯子邊界，這表明這兩個哺乳動物蛋白與OCX-32之間存在著進化聯系（即基因復制后的分化）[34，35]。為了進一步研究OCX-32的功能，Xing等[21]在大腸桿菌中將其與谷胱甘肽轉硫酶（Glutathione S-transferases，GST）融合形成重組蛋白，重新折疊的GST-OCX-32顯著抑制了牛羧肽酶的活性，也抑制了枯草芽孢桿菌的生長，這表明OCX-32可為雞蛋提供抗菌保護，也間接支持了角質層是抵抗不良環境和微生物入侵的第一道屏障的觀點[36]。

2.4 存在的隱性功能

除此之外，許多研究人員還對OCX-32進行了單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）檢測，發現OCX-32能顯著影響禽蛋的其他性狀，但具體機理還有待于進一步研究探索。張麗萍等[37]將OCX-32基因多態性與昆靈雞產蛋性狀進行關聯分析，發現6612A/G和6760A/T 兩個位點對蛋黃重有顯著影響（P<0.05），6566G/A位點對蛋白高度有顯著影響（P<0.05）。Uemoto等[38]分析了OCX-32表達量與產蛋性能之間的關系，發現產蛋性能低時，OCX-32表達量高;相反，產蛋性能高時，OCX-32表達量低，這表明OCX-32與產卵率有顯著相關性。李俊營等[23]研究了淮南麻黃雞OCX-32基因與蛋品質的相關性，發現494A/C位點對蛋白高度、開產蛋質量和哈氏單位有顯著影響（P<0.05）。Fulton等[33]同樣對OCX-32基因多態性與蛋品質的相關性進行了分析，發現了8種商品蛋雞的OCX-32基因存在28個SNPs位點，其中18個SNPs可改變蛋白質的氨基酸序列，對蛋殼顏色有顯著影響（P<0.05）。Dunn等[39，40]對OCX-32基因多態性與乳突層性狀相關性進行了2次分析，結果都表明了OCX-32基因的SNPs變化與蛋殼乳突層厚度呈顯著相關（P<0.05）。

3 結語

蛋殼形成的實質是有機基質與碳酸鈣晶體同時在蛋殼膜上沉積的過程。目前的研究主要集中在OCX-32對蛋殼終止鈣化和抗菌防御的調節上[41]，但關于其自身三維結構和修飾機制的研究仍處于初始階段，同時OCX-32作為一種重要的子宮液蛋白，與乳突層厚度和多種蛋品質性狀如蛋殼顏色、蛋白高度和蛋黃質量顯著相關，由于OCX-32主要位于蛋殼的外部，因此這種關聯的機制尚不清楚，有待于進一步深入研究。

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