外周血巨噬細胞移動抑制因子、人類白細胞DR 抗原表達對自身免疫性卵巢早衰的診斷價值

王 群 羅明艷

1.成都市新都區中醫醫院婦科，四川成都 610000；2.西部戰區總醫院婦產科，四川成都 610000

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）指40 歲以前出現的卵巢功能衰竭，POF 患者同正常絕經期女性一樣可伴圍絕經綜合征，嚴重影響患者身心健康[1-2]。自身免疫性卵巢早衰（autoimmune premature ovarian failure，APOF）指免疫因素導致的POF，占POF 的20%～30%[3]。目前診斷APOF 主要依靠卵巢穿刺活檢，但該方法有創且不能完全反映卵巢狀態。巨噬細胞移動抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）是一種多嗜性炎癥細胞因子，在先天免疫和適應性免疫中具有上游調節作用，參與類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、腮腺炎等自身免疫性疾病的發病機制[4-6]。人類白細胞DR 抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）是免疫細胞活化敏感指標，參與自身免疫性疾病的發病和進展[7]。MIF、HLA-DR 是否參與APOF 發病尚不清楚，本研究檢測POF 患者外周血MIF、HLA-DR 表達，探討其在APOF 中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年6 月至2020 年6 月成都市新都區中醫醫院（以下簡稱“我院”）收治的124 例POF 患者，納入標準[8]：①年齡＜40 歲，閉經3 個周期或6 個月以上；②促卵泡激素＞40 U/L，雌二醇（estradiol，E2）≤50 pg/ml；③超聲提示無卵泡、子宮小。排除標準：①多囊卵巢綜合征；②卵巢或子宮切除；③近期服用免疫抑制劑，激素類藥物。APOF 診斷標準：在POF 診斷基礎上需滿足抗卵巢抗體（antiovary antibody，AOAb）、抗透明帶抗體（anti zona pellucida antibody，AZpAb）、抗核抗體（antinuclear antibodies，ANA）等至少一項抗體陽性[9]；病理學發現卵巢細胞減少，漿細胞、淋巴細胞浸潤。根據APOF 診斷標準將患者分為APOF 組（45 例），NAPOF 組（79 例），另選擇同期我院婦產科門診體檢的60 名健康女性為對照組。本研究經我院醫學倫理會批準，所有受試者均知情同意并簽署同意書。

1.2 檢測方法

患者入院次日清晨（體檢者體檢當日清晨）采集空腹靜脈血6 ml 分別注入干燥試管和肝素抗凝管，干燥試管標本離心（3000 r/min，離心時間15 min，離心半徑10 cm）后取血清-80℃保存待檢。酶聯免疫吸附試驗檢測MIF、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、E2水平，儀器為Elx800 酶標儀（美國BioTek 公司），試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療公司（MIF、LH、FSH 試劑盒生產批號：180211，E2試劑盒生產批號：200511）。金標免疫斑點法測定AOAb、AZpAb、ANA，抗體購自美國Santa 公司（AOAb、AZpAb 生產批號：180912，ANA 生產批號：191003）。

肝素抗凝管標本充分混勻后制備淋巴細胞懸液，采用EPICS-XL 流式細胞儀檢測，免疫雙熒光法檢測HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+占淋巴細胞的百分比，試劑為異硫氰酸熒光素-鼠抗HLA-DR 單克隆IgG 抗體。抗體購自美國Santa 公司（生產批號：180211）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；兩兩比較采用Bonferroni方法校正。二元logistic 逐步回歸分析APOF 發病危險因素。受試者操作特征曲線分析MIF、HLA-DR 診斷APOF 的價值。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組基線資料及MIF、HLA-DR 比較

APOF 組AOAb、AZpAb、ANA 陽性占比及MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+水平高于NAPOF 組和對照組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；NAPOF組MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+水平高于對照組，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。APOF 組、NAPOF 組孕次、E2水平低于對照組，差異均有統計學意義（P ＜0.05）；月經初潮年齡及血清LH、FSH 水平高于對照組，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。APOF 組合并自身免疫性疾病占比高于NAPOF 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 三組基線資料及MIF、HLA-DR 比較

2.2 不同病情APOF 患者MIF、HLA-DR 水平比較

合并自身免疫性疾病、AOAb 陽性、AZpAb 陽性、ANA 陽 性APOF 患 者MIF、HLA-DR+CD3+、HLADR+CD19+水平高于未合并自身免疫性疾病、AOAb陰性、AZpAb 陰性、ANA 陰性患者，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 不同病情APOF 患者MIF、HLA-DR 水平比較（）

表2 不同病情APOF 患者MIF、HLA-DR 水平比較（）

注：與未合并自身免疫性疾病/AOAb/AZpAb/ANA 陰性比較，aP ＜0.05。APOF：自身免疫性卵巢早衰；AOAb：抗卵巢抗體；AZpAb：抗透明帶抗體；ANA：抗核抗體；MIF：巨噬細胞移動抑制因子；HLA-DR：人類白細胞DR 抗原

2.3 APOF 發病的影響因素分析

124 例POF 患者以是否發生APOF 為因變量（賦值：0=否，1=是），MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+、AOAb、AZpAb、ANA（均為連續變量原值帶入），合并自身免疫性疾病（賦值：0=否，1=是）為自變量，建立logistic 回歸方程，逐步法排除無關變量。結果顯示合并自身免疫性疾病，高MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+水平是APOF 發病的危險因素（OR ＞1，P ＜0.05）。見表3。

表3 APOF 發病的影響因素分析

2.4 MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+診斷APOF效能分析

聯合MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+診斷APOF 的曲線下面積高于單獨MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+診斷（Z=3.261、2.956、3.512，P ＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+診斷APOF 受試者操作特征曲線

表4 MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+診斷APOF 效能分析

3 討論

POF 是多種病因導致的卵巢功能早衰，自身免疫系統紊亂是主要原因之一，以卵巢相關自身抗體出現，卵巢淋巴細胞性浸潤，合并其他自身免疫性疾病為特征。目前臨床缺乏敏感性和特異性高的生物學指標，因此探討與APOF 免疫功能紊亂的生物學指標具有重要意義[10]。

MIF 是由活化T 淋巴細胞分泌的多功能細胞因子，具有抑制P53 介導的細胞凋亡，抑制糖皮質激素效應，參與固有和適應性免疫、自身免疫疾病、炎癥反應等病理生理過程[11-13]。既往研究顯示MIF 在白癜風[14]、類風濕關節炎[15]中水平升高，與病情和進展均有關。本研究結果顯示，高MIF 水平是APOF 發病的危險因素之一，MIF 參與了APOF 發病機制。APOF 患者多伴自身免疫疾病以及多種自身免疫抗體，高濃度抗體可引起和加重卵巢功能衰退[16-17]。本研究結果顯示，在合并自身免疫疾病、AOAb、AZpAb、ANA 抗體陽性表達者中MIF 水平高（P ＜0.05），提示MIF 參與APOF 自身免疫系統紊亂。可能的機制為MIF 增加巨噬細胞吞噬作用影響固有免疫，MIF 作為初始炎癥因子促使白細胞介素-2、白細胞介素-6、白細胞介素-8、前列環素等炎癥因子釋放，放大炎癥反應，加重APOF 自身免疫系統紊亂。

HLA-DR 是HLA 的Ⅱ類抗原，主要定位于巨噬細胞和B 淋巴細胞表面，通過結合提呈抗原肽，活化T 細胞，啟動免疫應答，是免疫細胞活化指標[18-19]。研究顯示，多發性硬化癥[20]、類風濕關節炎[21]患者外周血單核細胞HLA-DR 均呈高表達，可為類風濕關節炎早期診斷提供參考[22]。本研究結果顯示，HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+與APOF 發病有關。分析原因為機體炎癥性反應刺激腫瘤壞死因子、γ 干擾素、白細胞介素等炎癥細胞因子合成和釋放，誘導CD3+、CD19+細胞表達HLA-DR，HLA-DR 高度表達導致T細胞過度活化，加重免疫系統紊亂，引發APOF。Li 等[23]研究顯示，HLA-DR 可誘導特異性T 細胞反應，參與自身免疫性甲狀腺炎的發病過程。本研究結果顯示，HLA-DR 表達與APOF 合并自身免疫性疾病、AOAb、AZpAb、ANA 抗體表達存在一定關系，可能是因為HLA-DR 過表達激活自身抗體表達，導致自身免疫疾病發病。系統性紅斑狼瘡相關自身抗體的產生也被證明是T 細胞依賴和HLA-DR 限制抗原驅動所致[24]。

受試者操作特征曲線結果顯示，MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+聯合可提高APOF的診斷效能，提示MIF、HLA-DR 均上調可能意味著患者APOF發病風險更大。本研究結果顯示，合并自身免疫性疾病與APOF 發病有關，相關報道指出APOF 患者多合并類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[25-26]，紅斑狼瘡患者體內激素水平紊亂，也可導致卵巢功能早衰[26]。

綜上所述，APOF 患者MIF、HLA-DR+CD3+、HLADR+CD19+水平升高，高MIF、HLA-DR+CD3+、HLADR+CD19+水平是APOF 發病的危險因素。聯合MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+可為APOF 診斷提供有效參考。