不同培養溫度及孢子稀釋液對黑牛肝菌孢子萌發的影響*

羅順珍，陳 燕，曹 旸，紀光燕，陶 玲，晏汐蓓，紀開萍

（景洪宏臻農業科技有限公司，云南 景洪 666100）

黑牛肝菌 [Phlebopus portentosus(Berk．&Broomo)Boedijn]，又名暗褐網柄牛肝菌，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（Agaricomycetes） 牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脈柄牛肝菌屬（Phlebopus），分布于斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭等國家，國內廣西、海南、云南等省均有分布[1－7]，其子實體味道鮮美，營養豐富，具有很高的經濟價值。

目前，黑牛肝菌已實現了工廠化周年栽培[8]。在食用菌栽培產業中，需要不斷選育新的品種，以提高生產效率，增加商品價值和降低菌種退化風險。與其他有漫長栽培歷史的食用菌種類相比，黑牛肝菌工廠化栽培作為新興產業，其需求更加明顯。在食用菌品種選育中，雜交育種是使用最廣泛，收效最顯著的手段之一，其原理是通過單單雜交、雙單雜交或多孢雜交等方法實現基因重組，并從其后代中篩選優良菌株[9]。因此，通過有性孢子萌發獲得單倍體菌絲，是許多食用菌雜交育種工作的前提。因此，通過調整培養溫度，浸泡時間，以及孢子稀釋液的pH、添加碳源、氮源等條件，對黑牛肝菌的擔孢子萌發特性進行了探索，為其雜交育種工作奠定基礎，具有較強的理論應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黑牛肝菌擔孢子采自工廠化栽培菇房所生產的成熟子實體，菌株編號HZ14080。

1.2 培養基及儀器用具

培養基為M1固體培養基[10]。試驗儀器包括LS-75HD型滅菌鍋，江陰濱江醫療設備有限公司；SWCJ-1F型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；FE20型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FYL-YS-403L型恒溫培養箱，北京福意電器有限公司。

1.3 黑牛肝菌擔孢子的收集

在工廠化栽培菇房中預留黑牛肝菌子實體，即將成熟時采收。以無菌水沖洗子實體后，用75%酒精對其進行表面消毒，并用解剖刀去除菌柄。菌蓋于室溫下置于滅菌濾紙片上，室溫下放置12 h～24 h后即形成孢子印，隨即將該濾紙片剪成條狀放入滅菌試管備用。

1.4 不同培養溫度對孢子萌發的影響

用血球計數板進行計數，以無菌水將孢子稀釋至濃度3×104個/mL。將制好的孢子懸浮液充分震蕩后，取200 μL，在M1固體培養基上涂布后分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃培養箱中培養50 d，每個處理6個重復。

1.5 浸泡時間對孢子萌發的影響

以無菌水將孢子稀釋至濃度3×104個/mL，并分別在室溫下取200 μL直接涂布M1固體培養基（未浸泡）、放置12 h、24 h、36 h、48 h、60 h，取200 μL涂布于M1固體培養基，30℃培養50 d，每個處理6個重復。

1.6 孢子稀釋液pH對孢子萌發的影響

以1 mol·L-1的HCl或NaOH制備pH分別為4、5、6、7、8、9的無菌水，以未調pH的無菌水作為空白對照（CK），稀釋黑牛肝菌擔孢子至濃度3×104個/mL。取200 μL涂布于M1固體培養基，30℃培養50 d，每個處理6個重復。

1.7 不同碳源稀釋液對孢子萌發的影響

分別配置1%的蔗糖、果糖、淀粉、乳糖以及葡萄糖溶液，滅菌后用于稀釋孢子，以無菌水作為空白對照（CK），稀釋至濃度3×104個/mL后，取200 μL涂布于M1固體培養基，30℃培養50 d，每個處理6個重復。

1.8 不同氮源稀釋液對孢子萌發的影響

分別配置0.1%的酵母浸膏、蛋白胨、酒石酸銨、牛肉浸膏以及尿素溶液，滅菌后用于稀釋孢子，以無菌水作為空白對照（CK），稀釋至濃度3×104個/mL后，取200 μL涂布于M1固體培養基，30℃培養50 d，每個處理6個重復。

1.9 數據分析

由于黑牛肝菌的孢子萌發試驗未見文獻報道，多次試驗發現黑牛肝菌孢子萌發率極低，而將萌發形成的菌落數目作為統計分析對象。因此，對以上試驗每個重復中萌發的菌落數目進行統計，并利用DPS V7.05軟件，以單因素方差分析比較不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

黑牛肝菌孢子萌發形成的菌落形態見圖1。

圖1 黑牛肝菌孢子萌發形成的菌落形態Fig.1 Colony morphology of Phlebopus portentosus spore germination

由圖1所示，黑牛肝菌孢子萌發的菌落形態之間具有一定的形態差異，這屬于黑牛肝菌孢子的遺傳物質所決定。同一黑牛肝菌子實體收集的孢子印中孢子在不同的處理條件下黑牛肝菌孢子萌發的菌落形態無較大差別。

2.1 不同培養溫度對孢子萌發的影響

不同培養溫度對孢子萌發的影響見表1。

如表1所示，黑牛肝菌孢子在15℃～35℃均能萌發，在30℃下的平均萌發數顯著高于15℃及20℃下的平均萌發菌落數，30℃下培養也具有最高的中位數，說明溫度對黑牛肝菌的孢子萌發有一定的影響，30℃為最適溫度。

表1 不同培養溫度下的萌發菌落數Tab.1 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores under different culture temperature

2.2 浸泡時間對孢子萌發的影響

浸泡時間對黑牛肝菌孢子萌發的影響見表2。

表2 不同浸泡時間后的萌發菌落數Tab.2 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores with different soaking times

由表2可知，在進行涂布培養之前，對黑牛肝菌孢子進行浸泡會對其萌發產生一定的影響。其中，浸泡24 h的萌發菌落數與其他浸泡時間相比有顯著差異，中位數也是其他試驗的兩倍以上。隨著浸泡時間的延長，萌發菌落數有所下降。浸泡60 h后，孢子不能萌發。

2.3 孢子稀釋液pH對孢子萌發的影響

孢子稀釋液pH對孢子萌發的影響見表3。

由表3可知，對孢子稀釋液設置了6個不同的pH梯度，培養后發現pH為6的孢子稀釋液萌發數最高，與其他pH稀釋液相比差異具有顯著性，但與未調pH的無菌水對照之間差異不顯著。pH為4、8和9時，萌發數顯著低于對照，說明對孢子萌發產生了抑制作用。

表3 不同pH稀釋液中的萌發菌落數Tab.3 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores with dilutions of different pH

2.4 不同碳源稀釋液對孢子萌發的影響

不同碳源稀釋液對孢子萌發的影響見表4。

表4 不同碳源稀釋液中的萌發菌落數Tab.4 Germination numbers of Phlebopus portentosus spores with dilutions of different carbon sources

由表4可知，以1%的葡萄糖溶液稀釋黑牛肝菌孢子，得到了較高的萌發菌落數。與同濃度的淀粉、果糖和乳糖溶液相比，差異具有顯著性。與添加蔗糖和CK相比，差異不顯著。

2.5 不同氮源稀釋液對孢子萌發的影響

不同氮源稀釋液對孢子萌發的影響見表5。

由表5可知，在稀釋液中添加0.1%的不同氮源后發現，添加酒石酸銨和尿素后，萌發菌落數目顯著高于添加蛋白胨，酵母浸膏和CK處理，與添加牛肉浸膏的處理無顯著差別。

表5 不同氮源稀釋液中的萌發菌落數Tab.5 Germination of Phlebopus portentosus spores with dilutions of different nitrogen sources

3 討論

孢子萌發是食用菌育種工作的重要環節。由試驗結果可知，黑牛肝菌的擔孢子萌發相對困難。在前期的研究工作中，其孢子萌發所需的培養時間較長，從培養后10 d開始有零星的萌發菌落出現，至培養后50 d，其間不斷會有新的萌發菌落出現，因此將統計萌發菌落的培養時間設為50 d。

另一方面，黑牛肝菌的孢子萌發率也較低，按本研究中萌發菌落數目最高的處理計算，也約為0.1%，這與其他栽培食用菌相比差距較大。如草菇（Volvariella volvacea） 的孢子萌發率在培養48 h后可達30%以上[11]，香菇（Leotinula edodes） 孢子培養10 d后可達60%以上[12]，貯藏4個月的金針菇（Flammulina velutipes） 擔孢子培養24 h后，其萌發率甚至能達到100%[13]。相反，還不能進行人工栽培的外生菌根菌，如蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），在培養7 d后也僅有“極少量”的孢子開始萌發[14]，與本研究中的黑牛肝菌較相似。造成這種差別的原因可能是擔孢子萌發率高的食用菌主要為腐生菌，在人工合成的培養基上能夠快速生長，而作為外生菌根菌的蘭茂牛肝菌，利用人工培養基的能力相對較弱，也就影響了孢子萌發率。黑牛肝菌是否是外生菌根菌，目前還存在爭議，但可以肯定的是，其腐生能力遠低于一般的腐生食用菌[15-17]，這可能也是其孢子萌發較困難的原因。

在本研究中，嘗試通過調整培養溫度、浸泡時間、孢子稀釋液pH，以及添加碳源、氮源等條件，提高黑牛肝菌擔孢子萌發率，發現30℃下培養、涂布前浸泡24 h、調節孢子稀釋液pH至6、在稀釋液中添加1%葡萄糖、0.1%酒石酸銨或尿素，均能在一定程度上提高黑牛肝菌的擔孢子萌發菌落數。在今后的工作中，還將繼續對黑牛肝菌的孢子萌發進行研究，包括不同菌株間萌發能力的差別、萌發培養基改良、萌發前預處理等，希望能大幅度提高黑牛肝菌孢子萌發能力，為雜交育種工作提供更多更豐富的種質材料。