混菌固態(tài)發(fā)酵白酒酒糟制蛋白飼料的研究

楊麗華， 張婷婷， 孟建宇

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010011）

我國(guó)是白酒釀造大國(guó)，每年白酒鮮酒糟的產(chǎn)量高達(dá)2400多萬(wàn)t，干糟產(chǎn)量可達(dá)約800萬(wàn)t（姚焰礎(chǔ)等，2020），是一種廉價(jià)而優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)原料。但目前白酒酒糟的主要用途為晾干后作為粗飼用或直接廢棄，其含水量高，堆放時(shí)會(huì)有污水大量滲出，滲濾液中含有大量的高酸度污染物，會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染（楊新等，2019；Ao等，2019）。然而，白酒酒糟中含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量是其他農(nóng)作物的幾倍，粗纖維含量較少，而且還含有多種維生素、氨基酸和微量元素等有益成分（劉志云等，2020；宋立立和劉苗，2020），是很好的蛋白質(zhì)飼料原料來(lái)源（李建和葉翔，2013）。利用微生物發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵酒糟生產(chǎn)高蛋白質(zhì)飼料，是提高酒糟商業(yè)附加值，實(shí)現(xiàn)白酒酒糟大規(guī)模資源化利用，解決動(dòng)物蛋白質(zhì)飼料短缺，增加飼料領(lǐng)域經(jīng)濟(jì)效益的重要手段（胡志強(qiáng)等，2019；高銘坤等，2018）。

混菌發(fā)酵是通過兩個(gè)或多個(gè)菌株之間的互惠共生作用，將粗纖維等生物大分子分解成動(dòng)物易消化吸收的小分子的高效發(fā)酵技術(shù)（宋立立和劉苗，2020），顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵。余乾偉等（2014）研究表明，混合真菌發(fā)酵可使蛋白飼料中粗蛋白質(zhì)含量提高到29.8%。宋善丹等（2015）以米曲霉、黑曲霉和酵母菌混合發(fā)酵白酒糟發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵后各種氨基酸含量較發(fā)酵前明顯提高。張玉誠(chéng)等（2016）用四種混合菌固態(tài)發(fā)酵白酒糟發(fā)現(xiàn)，氨基酸含量提高了24.47%，蛋白質(zhì)含量提高了57.85%。利用混菌發(fā)酵生產(chǎn)的動(dòng)物蛋白飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有效提高了蛋白質(zhì)含量，明顯降低了粗纖維素含量，極大減少了產(chǎn)氣量，并且富含多種維生素、礦物質(zhì)和生物活性物質(zhì)等生理代謝不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素（Rahman等，2016），利于動(dòng)物消化吸收，具有非常廣闊的市場(chǎng)前景（王蘊(yùn)等，2020）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 白酒酒糟：由內(nèi)蒙古馳園酒業(yè)提供，含水量為73%，烘干后保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株：酵母菌為異常漢遜酵母J-1（Hansenula anomala J-1），纖維素降解菌為枯草芽孢桿菌K-2（Bacillus subtilis K-2）、解淀粉芽孢桿菌K-3（Bacillus amyloliquefaciens K-3）和檸檬酸菌N-10（Citrobacter sp.N-10），所用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室前期篩得的菌種。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：蛋白胨2%、葡萄糖2%、酵母提取物1%、瓊脂2%，115℃滅菌35 min。羧甲基纖維素鈉（CMCNa）固體培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g、K2HPO41.0 g、Mg-SO40.5 g、（NH4）2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、剛果紅0.5 g、瓊脂20 g。CMC-Na液體培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、（NH4）2SO42.0 g、NaCl 2.5 g、牛肉膏2.5 g、胰蛋白胨5.0 g。產(chǎn)糖培養(yǎng)基：粉碎過80目篩的白酒酒糟10 g加到1 L蒸餾水中，115℃滅菌35 min。

1.2 菌種活化 將異常漢遜酵母J-1接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h；將枯草芽孢桿菌K-2、解淀粉芽孢桿菌K-3和檸檬酸菌N-10接種于CMC-Na固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72 h。由于菌株在低溫保藏期間活力會(huì)有較大的下降，所以本試驗(yàn)所用菌株均活化10代以上使用。其中，活化后的酵母菌接種于無(wú)瓊脂的YPD培養(yǎng)基中，纖維素降解菌接種于CMC-Na液體培養(yǎng)基中30℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后使用。

1.3 纖維素降解菌產(chǎn)糖試驗(yàn) 將纖維素降解菌接種于產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，每隔一段時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基中的糖含量進(jìn)行測(cè)定，利用3-5二硝基水楊酸法（DNS法）繪制產(chǎn)糖曲線。

1.4 最佳接種條件的優(yōu)化

1.4.1 纖維分解菌接種量的優(yōu)化 分別接種0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%的纖維素降解菌于酒糟中，發(fā)酵24 h后接種0.3%酵母菌再發(fā)酵72 h，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定：將1 g發(fā)酵物溶于10 mL無(wú)菌水中，充分振蕩后取1 mL上清液稀釋50倍，用滴管滴1小滴于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室，再滴等體積的1%次甲基藍(lán)溶液，沉淀染色3 min后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

活菌數(shù)/mL=A/5×25×104×B；

面南嶺，建經(jīng)臺(tái)；倚北阜，筑講堂；傍危峰，立禪室；臨浚流，列僧房。對(duì)百年之高木，納萬(wàn)代之芬芳。抱終古之泉源，美膏液之清長(zhǎng)。[10](《謝靈運(yùn)傳》，P1765)

式中：A為5個(gè)中格的平均菌數(shù)；B為稀釋倍數(shù)，本試驗(yàn)中B=100。

1.4.2 酵母菌最佳接種時(shí)間的優(yōu)化 接種0.6%的纖維素降解菌于酒糟中，用血球計(jì)數(shù)板分別測(cè)定發(fā)酵12、24、36、48、60 h時(shí)接種0.3%酵母菌發(fā)酵72 h后酵母菌的活菌數(shù)量。

1.5 發(fā)酵試驗(yàn) 將經(jīng)上述處理過的酒糟與同時(shí)接種兩種細(xì)菌、只接種一種細(xì)菌、不接種的樣品形成對(duì)照，在酵母菌接種量為0.3%、含水率為40%、酒糟填料量為15 g、纖維素降解菌接種量為0.6%、發(fā)酵72 h的條件下，按照國(guó)標(biāo)（GB 5009.5-2010）中的方法測(cè)定粗蛋白質(zhì)的含量（林智，2010）。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌產(chǎn)糖試驗(yàn) 菌株的生長(zhǎng)與繁殖需要各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中最為關(guān)鍵的是糖類物質(zhì)，然而酒糟中可被酵母利用的可溶性糖類在發(fā)酵中被大量消耗，直接使用酵母菌發(fā)酵蛋白飼料，其蛋白成分的上升空間極為有限。在本研究中，先分析纖維素降解菌的產(chǎn)糖能力，進(jìn)一步確定是否使用該菌株進(jìn)行發(fā)酵。各纖維素降解菌的產(chǎn)糖能力如圖1所示。

圖1 纖維素降解菌的產(chǎn)糖能力

由圖1可以看出，發(fā)酵液在發(fā)酵初期的糖含量下降較快，在12 h時(shí)基本將發(fā)酵液中的糖分（其中的糖分全部由酒糟自身提供）消耗完畢，隨后所有發(fā)酵體系中糖含量均有上升的趨勢(shì)，其中菌株K-2與K-3的產(chǎn)糖較多，可見其對(duì)酒糟中纖維素分解能力較強(qiáng)。菌株K-2的產(chǎn)糖能力最強(qiáng)，所以將其用于后面的試驗(yàn)。

2.2 最佳接種條件的優(yōu)化 為確定菌株K-2接種量對(duì)酵母菌J-1生長(zhǎng)可能造成的影響，首先設(shè)置不同梯度的枯草芽孢桿菌K-2接種量接種于酒糟中，發(fā)酵24 h后接種0.3%酵母菌再發(fā)酵72 h，利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖2。在確定菌株K-2最佳接種量后，需要進(jìn)一步對(duì)酵母菌J-1接種于發(fā)酵體系的最佳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以確保酵母菌J-1可以進(jìn)行最好的生長(zhǎng)繁殖，圖3是針對(duì)不同枯草芽孢桿菌K-2處理時(shí)間接種酵母菌培養(yǎng)72 h后酵母菌J-1數(shù)量的變化。

由圖2和圖3可知，高接種量的K-2菌或固態(tài)發(fā)酵體系經(jīng)K-2菌長(zhǎng)時(shí)間處理后，酵母菌J-1活菌數(shù)快速下降。這有可能是因?yàn)榇藭r(shí)的枯草芽孢桿菌K-2成為了固態(tài)發(fā)酵體系中的優(yōu)勢(shì)菌群，從而抑制了酵母菌J-1的生長(zhǎng)。0.6%K-2菌株的接種濃度比較適合J-1菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖2 纖維素降解解菌接種量的優(yōu)化

圖3 酵母菌接種時(shí)間的優(yōu)化

2.3 發(fā)酵試驗(yàn) 根據(jù)不同的發(fā)酵方式設(shè)置4個(gè)試驗(yàn)組與1個(gè)對(duì)照組，分別為經(jīng)2.2優(yōu)化處理過的酒糟組（A組），同時(shí)接種J-1和K-2組（B組），只接種K-2組（C組），只接種J-1組（D組）和不經(jīng)過任何處理的酒糟對(duì)照組（E組），在酵母菌J-1接種量為0.3%、含水率為40%、酒糟填料量為15 g、纖維素降解菌K-2接種量為0.6%、發(fā)酵72 h的條件下，各組的粗蛋白質(zhì)含量見圖4。對(duì)照組的酒糟粗蛋白質(zhì)含量為16.15%（干基），C組和D組的單菌發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量提高不明顯，分別達(dá)到17.39%和18.23%，B組經(jīng)過混菌發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量提高到了20.55%，而優(yōu)化處理的試驗(yàn)A組粗蛋白質(zhì)提高幅度最大，達(dá)到了25.91%。

圖4 不同試驗(yàn)組粗蛋白質(zhì)含量

3 結(jié)論與討論

白酒是我國(guó)重要的傳統(tǒng)食品，白酒的生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生大量的酒糟，有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每生產(chǎn)1 t白酒，將會(huì)有6～10 t酒糟產(chǎn)生（李覓等，2018）。以酒糟為原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)制作纖維酵解綠色產(chǎn)品，能顯著提高粗蛋白質(zhì)含量（李慧芬和馬成，2017），是實(shí)現(xiàn)酒糟大規(guī)模資源化利用和解決環(huán)保問題的有效途徑（王和玉等，2015；郭夏麗等，2014）。

酵母菌本身具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可以促進(jìn)動(dòng)物胃腸道的菌群平衡，改善消化能力，增強(qiáng)免疫力，有助于動(dòng)物健康，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用前 景 廣 泛 （Amayadelgado等，2013；Liang等，2009；Klosowski等，2006）。白酒酒糟中含有豐富的蛋白質(zhì)，但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不均衡，有許多動(dòng)物難消化的纖維素等其他成分，所以直接飼用率極低，利用酵母菌對(duì)白酒酒糟再次發(fā)酵，可以提高酒糟的利用率及適口性。

由于酒糟本身所含的糖分在釀造白酒的過程中被大量消耗，直接使用酒糟來(lái)培養(yǎng)酵母菌的效果不是很理想。所以在發(fā)酵的過程中需要添加可以降解纖維素的外源菌株與酵母菌共同作用，提高飼料的利用率（郭素環(huán)等，2012；李日強(qiáng)等，2003）。有研究指出，同時(shí)接種酵母菌與纖維素降解菌對(duì)秸稈的降解率沒有較大的提升，而分次加入兩種菌進(jìn)行不同步發(fā)酵，可以明顯提升秸稈的降解率，軟化秸稈（陳風(fēng)風(fēng)，2013）。焦肖飛等（2015）用混菌對(duì)發(fā)酵白酒糟的研究顯示，當(dāng)接種枯草芽孢桿菌和白地霉培養(yǎng)24 h后，再接種產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)72 h，粗蛋白質(zhì)含量達(dá)32.09%。本研究首先用纖維素降解菌對(duì)纖維素類物質(zhì)進(jìn)行降解產(chǎn)生可溶性糖，然后接種酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)，使得酵母菌的數(shù)量可以有較大的提升。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)填料量為15 g、含水率為40%、溫度為30℃時(shí)，接種0.6%的枯草芽孢桿菌K-2 24 h后再加入接種量為0.3%的酵母菌J-1，發(fā)酵72 h后白酒酒糟的酵母菌活菌數(shù)達(dá)到最大，粗蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)25.91%，比發(fā)酵前提高了60.43%。本研究為混菌發(fā)酵白酒酒糟制備動(dòng)物蛋白飼料的深入開發(fā)提供了依據(jù)。