長鏈非編碼RNA PEG10在結直腸癌中表達的臨床意義和生物學功能

徐博文,王 巖,譚志軍

(1天津市第四醫院外科,天津 300222;2天津市第一中心醫院普外科;*通訊作者,E-mail:1578312514@qq.com)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,發病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第3位和第2位[1]。在中國每年新診斷的CRC病例超過34萬,其中半數以上的患者就診時已發生轉移,失去手術機會使得CRC的治療手段變得非常有限。近年來眾多臨床和基礎研究取得了巨大的進展,然而當前CRC治療的最大挑戰仍是準確評估每位患者術后的復發和預后[2]。目前,腫瘤-淋巴結-轉移(tumor-node-metastasis,TNM)分類系統仍作為評估CRC患者預后和復發的主要參考標準。然而,這一分級系統卻難以區分由腫瘤異質性所導致的生存預后差異。因此,越來越多的研究致力于獨立于現有的TNM分類標準,期待能夠找出準確評估CRC預后或轉移的腫瘤特異性分子,以作為早期發現轉移和治療干預措施的標志物,為這一惡性疾病的臨床治療帶來巨大的益處[3]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA)是一組轉錄本長度大于200個核苷酸,缺乏蛋白質編碼功能的RNA[4]。研究證實,lncRNA能夠作為癌基因或抑癌基因參與調控腫瘤細胞的惡性行為,其異常表達與多種的腫瘤發生、發展及預后轉歸密切相關[5]。例如,lncRNA CCAT1在腸癌細胞中的表達顯著增高,在腸癌標本中也具有顯著的組織特異性,說明該基因具有作為腫瘤標志物的潛力;機制上,CCAT1轉錄自經典的癌基因Myc的超增強子區域,通過上調Myc的轉錄作用而發揮癌基因作用;功能上,CCAT1與腫瘤的淋巴結轉移、以及Ⅱ/Ⅲ期腫瘤患者的預后不良都顯著相關[6]。這些研究說明lncRNA在腫瘤中的組織特異性表達或許能夠成為CRC新的預后標志物,lncRNA也由此成為腫瘤個體化治療研究領域一個新的研究熱點。然而,lncRNA調控CRC惡性進展的分子機制研究仍不夠全面,有關CRC轉移和復發的臨床分子標志物的研究也同樣處于起步階段。因此,本研究應用實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法在CRC臨床標本中檢測并分析父系表達遺傳印記基因10(paternally expressed 10,PEG10)的表達水平和預后意義,并進一步通過基因干擾的方式明確該基因對腫瘤細胞惡性表型的影響,試圖為CRC的預后評估及個體化治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床病理標本

選取2012年1月至2013年6月天津市第一中心醫院普外科收治的66例CRC患者為研究對象。其中,男性41例,女性25例;年齡34-72歲,平均(53.4±11.3)歲;根據國際抗癌聯盟指定的TNM分期,Ⅰ期18例,Ⅱ期25例,Ⅲ期10例,Ⅳ期13例。納入標準:①術后組織病理學檢查確診為CRC;②術前未進行放化療等治療;③臨床病理資料完整,且隨訪資料完整;④患者及家屬均簽署知情同意者。排除標準:①嚴重心臟、肝、腎功能障礙,或并發其他嚴重疾病的患者;②存在遠處轉移或合并其他部位惡性腫瘤者;③術前合并感染性疾病者;④不配合隨訪的患者;⑤中途轉院或放棄治療的患者。無進展生存時間(progression-free survival time,PFS)為術后第1天至首次發現腫瘤復發、患者死亡或至隨訪截止日期。總生存時間(overall survival,OS)為術后第1天至患者死亡或隨訪截止日期。本研究隨訪時間截至2018年6月,共66例患者均獲得完整術后隨訪數據,中位OS為(32.0±16.79)個月,中位PFS為(28.0±17.37)個月。

本研究經醫院醫學倫理委員會批準,且所有患者均簽署知情同意。全部患者均接受結腸癌根治性切除術。組織標本包括腫瘤組織及癌旁正常對照組織(與腫瘤組織距離大于2 cm),在首次手術切除后快速取材放置于5倍組織體積的RNA later(Thermo Fisher,維爾紐斯,立陶宛)中,液氮中短暫保存后-80 ℃冰箱中凍存待檢。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)

RNA提取試劑盒購自Transgene公司,反轉錄PCR試劑盒購自Promega公司,SYBR Master Mix聚合酶及RNA酶抑制劑均購自日本TaKaRa公司,ABI7100實時定量PCR儀器購于美國ABI公司,lncRNA PEG10及內參GAPDH引物由均由上海生工生物工程有限公司設計并合成,lncRNA PEG10上游序列:5′-CATCCTTCCTGTCTT CGC-3′,下游:5′-CCCTCTTCCACTCCTTCTTT-3′;GAPDH上游:5′-TGGTATCGTGGA AGGACTCA-3′,下游:5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′。Trizol法提取組織總RNA后進行反轉錄反應合成cDNA,體系如下:總RNA 1 μg、正反鏈引物各1 μl、無RNA酶水8 μl;反應條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 5 min。根據SYBR Master Mix PCR試劑盒說明書制備反應體系進行PCR擴增,體系如下:ddH2O 13.8 μl、SYBR Master Mix 10 μl、cDNA模板1 μl、上下游引物各0.1 μl;反應條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸1 min,共40個循環。lncRNA PEG10的表達水平以2-ΔΔCt的方法進行評估,實驗重復3次。

1.3 細胞培養及轉染

人腸癌細胞株HCT-116和DLD-1購自上海生科院細胞資源中心,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,37 ℃、5% CO2的加濕培養箱中培養。lncRNA PEG10短發夾RNA(sh-PEG10)及對照質粒(sh-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司,根據Invitrogen公司Lipofectamine 2000說明書轉染腸癌細胞株。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

轉染后24,48,72,96 h以CCK-8法測定細胞活力,按北京安必奇生物科技公司CCK-8檢測試劑盒使用說明書進行操作。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

細胞轉染20 h后,24孔板的Transwell小室(8 μm孔徑,美國Costar公司)中,Transwell上室中加入300 μl含(2-3)×104個細胞的無血清培養基;在下室中加入550 μl含10%胎牛血清的完全培養液。48 h后,0.1%結晶紫染色,顯微鏡下觀察、拍照并計數穿過小室的細胞。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 腫瘤組織和癌旁正常組織中lncRNA PEG10的表達差異

qRT-PCR結果表明,lncRNA PEG10在CRC組織和配對癌旁正常對照組織中的相對表達量分別為1.130±0.123和10.501±0.527。lncRNA PEG10在CRC組織中表達水平顯著高于配對癌旁正常組織,差異具有統計學意義(P<0.000 1,見圖1)。

2.2 CRC患者不同臨床病理特征中lncRNA PEG10的表達差異

以lncRNA PEG10 mRNA相對表達量中位數為標準,將CRC患者分為lncRNA PEG10高表達組(>10.501)和低表達組(<10.501)。lncRNA PEG10的表達水平與CRC患者年齡、性別、吸煙史、分化程度未見明顯統計學相關性。然而,lncRNA PEG10的表達水平與腫瘤浸潤深度(T分期,P=0.017)、淋巴結轉移情況(P=0.009)和TNM分期(P<0.000 1)等臨床病理資料之間表現出明顯的統計學相關性(見表1)。

與癌旁正常組織比較,***P<0.000 1圖1 lncRNA PEG10在CRC腫瘤組織和癌旁正常對照組織中的表達水平Figure 1 Expression of lncRNA PEG10 in CRC tissues and matched adjacent normal tissues

表1 lncRNA PEG10表達水平與CRC患者臨床病理資料之間的相關性 (例)Table 1 Correlations of lncRNA PEG10 expression with clinical variables in CRC patients (cases)

2.3 lncRNA PEG10的表達水平與CRC患者預后的關系

與lncRNA PEG10低表達的CRC患者相比,lncRNA PEG10高表達者PFS和OS顯著減少(PFS:38.27±16.95個月vs17.03±9.66個月,P=0.003 7;OS:41.82±13.97個月vs19.12±10.58個月,P=0.001 9,見圖2)。此外,單因素分析表明,腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期和PEG10的表達水平與CRC患者OS及PFS均有顯著的統計學相關性(見表2,3)。然而,患者性別、年齡、吸煙史與預后無關(見表2,3)。COX多因素回歸模型表明,lncRNA PEG10表達水平為CRC患者的獨立預后因素(見表3)。

圖2 CRC患者總生存期和無進展生存期與lncRNA PEG10表達水平之間的相關性Figure 2 Correlations of overall and progression-free survival time with lncRNA PEG10 expression in CRC patients

表2 CRC患者單因素和多因素的總生存期分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of overall survival in CRC patients

表3 CRC患者單因素和多因素的無進展生存期分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of progression-free survival in CRC patients

2.4 lncRNA PEG10對CRC細胞增殖的作用

為進一步明確lncRNA PEG10在CRC細胞惡性表型中的作用,我們在人CRC細胞株HCT-116和DLD-1中對lncRNA PEG10基因進行干擾。CCK-8細胞活力檢測結果表明,lncRNA PEG10干擾后,腫瘤細胞的增殖活力明顯減弱(見圖3)。

A.qRT-PCR方法檢測CRC細胞PEG10干擾效率 B.CCK-8法評估相應CRC細胞不同時間點的細胞活性與sh-Ctrl比較，**P<0.01,***P<0.001圖3 LncRNA PEG10在體外促進CRC細胞的增殖Figure 3 LncRNA PEG10 promotes CRC cell proliferation in vitro

2.5 lncRNA PEG10對CRC細胞侵襲和遷移的作用

Transwell侵襲實驗結果表明,sh-PEG10組CRC細胞的侵襲能力較sh-Ctrl組腫瘤細胞顯著減弱(HCT-116:50.67±8.41vs96.33±6.49,P=0.012 7;DLD-1:45.33±4.49vs101.02±7.51,P=0.003 1,見圖4)。與之相似,sh-PEG10組CRC細胞的遷移能力較sh-Ctrl同樣明顯降低(HCT-116:49.33±8.11vs128.7±23.15,P=0.031 9;DLD-1:43.33±7.22vs107.01±7.55,P=0.003 7,見圖5)。

圖4 Transwell實驗檢測lncRNA PEG10基因干擾對CRC細胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of lncRNA PEG10 inhibition on the invasion abilities of the CRC cells by Transwell assay

圖5 Transwell實驗檢測lncRNA PEG10基因干擾對CRC細胞遷移能力的影響Figure 5 Effect of lncRNA PEG10 inhibition on the migration abilities of the CRC cells by Transwell assay

3 討論

CRC患者治療的最大挑戰之一即為準確預測腫瘤的術后復發與預后,這能在眾多CRC患者中明確誰將受益于個體化的輔助治療[7]。臨床分期系統往往不能準確地區分大部分腫瘤患者的復發與預后,目前人們仍然嚴重地依賴傳統的病理變量。現今,腫瘤的TNM和Dukes分期系統依然是評估CRC患者預后的金標準。然而,臨床上相同TNM分期的患者在同一CRC階段的存活率常常表現出巨大的差異[8]。因此,作為評估CRC復發和預后的腫瘤相關分子,可為CRC的早期診斷、轉移的評估和治療干預措施的選擇提供重要依據。

隨著全基因組和轉錄組測序技術的發展,與腫瘤發生發展密切相關的lncRNA受到越來越多的關注。它們與DNA、RNA或蛋白質分子之間的組合相互作用,在染色質構型、轉錄和轉錄后調節中起著十分重要的調控作用,通過影響腫瘤細胞的惡性表型,從而作為CRC患者預后的特異性分子標志物出現在人們的視野[9]。例如,lncRNA MALAT1通過癌基因AKAP9促進結腸癌的發生和轉移,后者主要調控細胞紡錘體極化,因此過表達的MALAT1直接促進腸上皮細胞的分裂和分化,與腸癌的發生發展、淋巴結和遠處轉移、以及腫瘤分化程度等密切相關[10]。另外,lncRNA HOTAIR促進CRC遠處轉移,在CRC肝轉移時表達尤其顯著,其表達同樣與CRC的浸潤深度、淋巴結及遠處轉移呈正比[11]。與此相似,研究陸續發現lncRNA PEG10在多種人類腫瘤中高表達,沉默該基因能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移和浸潤的能力,提示lncRNA PEG10具有癌基因的功能[12-20]。

PEG10的表達水平受多種因素調控。轉錄因子如E2F、c-MYC和雄激素受體(AR)已被報道參與PEG10的表達調控。據報道E2F-1和E2F-4都能直接與PEG10啟動子結合,并上調其在肝癌中的轉錄[17]。E2F-1通過結合PEG10啟動子直接上調PEG10表達在前列腺癌和胰腺癌中也得到證實[15]。此外,在肺癌細胞中,GSK3β/USP11/E2F-1/PEG10通路在PEG10過度表達中起著重要作用[21]。另有報道Panc1細胞中的c-MYC敲除導致隨后的PEG10下調,芯片分析證實PEG10是c-MYC的直接下游靶點[22]。在前列腺癌中,AR被證實與PEG10啟動子區域結合,從而抑制PEG10的轉錄。用合成雄激素R1881治療前列腺癌細胞導致PEG10啟動子上AR占有率增加,而用AR拮抗劑恩扎魯胺治療時AR占有率降低[23]。雖然越來越多的研究逐漸揭示了lncRNA在腫瘤細胞中的癌性作用及分子機制,然而關于lncRNA在CRC轉移和預后中的預示作用卻鮮有報道。

鑒于CRC易于轉移的特性,手術將CRC完全切除幾乎是不可能的[24]。因此,參與腫瘤惡性進展的關鍵調控分子的表達情況能夠極大地影響CRC患者的惡性進展以及臨床預后[25,26]。近期的一項meta分析研究了lncRNA PEG10在人類實體瘤中表達的臨床意義[27]。他們發現lncRNA PEG10在膠質瘤、下咽癌、前列腺癌等人類多種實體瘤中均存在高表達,并且其表達情況與腫瘤細胞分化程度、淋巴結轉移以及TNM分期呈正相關。與這些研究相一致,我們的實驗同樣提示lncRNA PEG10高表達的患者通常腫瘤浸潤深度更深,更易于發生淋巴結轉移,TNM分期更晚,表明lncRNA PEG10的表達與CRC惡性進展密切相關。

另一方面,無限制的增殖能力是惡性腫瘤最顯著的生物學特性,而多項研究均證實了lncRNA PEG10促進腫瘤細胞增殖的癌基因特性[16]。研究表明,lncRNA PEG10的表達方式具有細胞周期依賴性的特點,它能夠誘導細胞從G0/G1向S期進展,進而促進腫瘤細胞增殖[15]。例如,lncRNA PEG10在肝細胞肝癌中大量表達,其基因干擾能夠顯著抑制肝癌腫瘤細胞的增殖[17]。此外,在MKN7細胞中lncRNA PEG10干擾同樣表現出以錨定非依賴的方式抑制克隆形成能力[16]。

我們的研究表明,lncRNA PEG10高表達能夠作為CRC患者獨立的不良預后因素(見表2,3),其高表達者的預后更差、腫瘤更易于復發(見圖2)。目前,CRC最有效的治療策略為手術聯合術后放/化療的綜合治療。然而,鑒于腫瘤細胞無限增殖、易于浸潤和轉移、以及凋亡抵抗的特性,一方面手術難以完全切除腫瘤,另一方面腫瘤細胞常常獲得放/化療耐受的能力,使得這些治療方式并不能達到完全治愈的效果。因此,腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、浸潤和轉移等能力將會極大的影響CRC患者的臨床預后。lncRNA PEG10的凋亡抵抗作用在肝細胞肝癌、B淋巴細胞性白血病、視網膜母細胞瘤等多種惡性腫瘤中均被證實[12,17,18],其促進增殖的作用在前列腺癌、下咽癌、食管癌等多種惡性腫瘤中也同樣被多次報道[13,14,19]。多項研究證實過表達lncRNA PEG10的惡性腫瘤更易于浸潤和轉移[13,14,19,28]。例如,通過上調MMP-1/2/9以及下調TIMP-1/2的表達,lncRNA PEG10能夠促進乳腺癌細胞系MDA-MB231細胞的浸潤和遷移[28]。另外,lncRNA PEG10在胰腺癌中能夠通過ERK/MMP-7信號通路促進腫瘤細胞的增殖、遷移和浸潤[15]。

綜上所述,本研究表明lncRNA PEG10在CRC惡性進展過程中發揮著重要作用,其高表達與CRC患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期程度、腫瘤的預后不良與復發均密切相關,并且能夠預示CRC患者的臨床預后與復發。在體外,lncRNA PEG10基因干擾能夠顯著抑制CRC腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移。lncRNA PEG10或許能夠為CRC患者的早期診斷、預后和復發的評估提供新的理論依據,為CRC的臨床治療提供新的分子靶點,但該分子在CRC發生發展中的具體分子機制仍需進一步研究。