小鼠Cdc25B突變型S15A熒光表達載體的構建及鑒定

馮少青,孟 峻

(1內蒙古醫科大學附屬醫院臨床檢驗診斷學教研室,呼和浩特 010059;2內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:nmfrank@163.com)

Cdc25B屬于細胞分裂周期25(cell division cycle 25,Cdc25)磷酸酶家族,它可以通過激活細胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)來驅動細胞周期,并且可以參與細胞周期檢查點的調控,其活性與其亞細胞定位和磷酸化狀態有直接關系[1,2]。在哺乳動物細胞周期調控過程中,Cdc25B主要在有絲分裂G2-M過渡階段激活CDK1-cyclin B而發揮作用[3]。Cdc25B已被證實是調節細胞周期進程的關鍵因子,它作為一種Thr/Tyr雙特異性的保守性磷酸酶,對無活性的前有絲分裂促進因子磷酸酶發揮雙重特異性作用,使之被修飾為具有活性的去磷酸化形式,進而恢復有絲分裂[4]。Cdc25B也被證實參與中心體復制和調控微管成核[5],并且是紅細胞前體細胞周期的關鍵調節因子,作為靶基因參與紅細胞的生成和分化[6]。

細胞周期失調是人類癌癥的一個共同特征,它至少會導致癌癥發展的兩個特征,即不受控制的細胞增殖和基因組不穩定[7,8]。而Cdc25B在細胞周期調控中發揮重要作用,并且Cdc25B的過表達已在多種人類癌癥中被觀察到,并與較差的臨床預后相關[9],這表明對Cdc25B的研究有助于更好地了解癌癥的作用機制及發現新的癌癥治療靶點。Cdc25B的過表達是一個復雜的過程,其中S15A可能是造成其磷酸化的關鍵位點。此研究旨在構建Cdc25B的突變型Cdc25B(S15A)的熒光質粒,為進一步研究Cdc25B及其突變體在小鼠受精卵G2/M期的作用做準備。

1 材料與方法

1.1 儀器與軟件

超凈工作臺(SW-OJ-2F,Airtech公司);超速離心機(Sigma公司);基因擴增儀(9600型,HEMA);電泳儀(JY600E,君意生物科技公司);CmSuite8(加拿大Corel公司);Sequencher(廣州贏森生物科技有限公司)。

1.2 材料與試劑

pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)載體由本課題組合成;限制性內切酶(Thermo Scientific公司);微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(B518131-0100,上海生工);質粒小提試劑盒(B518191-0050,上海生工);PrimeSTAR Max Premix(2X)(R045A,TaKaRa公司);TaKaRa Taq(R001B,TaKaRa公司);ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶(C113-2,諾唯贊公司);真核表達載體pcDNA3.1(+)、Stbl3感受態細胞(廣州輝駿生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計 結合實驗需求,利用CmSuite8軟件設計熒光基因EGFP和突變基因Cdc25B(S15A)的引物擴增序列(見表1),為進一步實驗做準備。此引物由鴻訊生物合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.2 擴增EGFP目的片段 以含目的基因的質粒為模板,使用Prime STAR高保真酶,按照TaKaRa Taq試劑盒說明書的操作步驟進行PCR反應,擴增熒光標簽EGFP,反應體系為:含EGFP的質粒模板50 ng;EGFP的上、下游引物各1 μl;Prime STAR Max(2×)10 μl,繼續加入ddH2O定容總體積到20 μl。PCR反應的條件為:96 ℃預變性5 min,96 ℃變性20 s;60 ℃退火30 s;72 ℃ 1 min;72 ℃延伸3 min,進行30個循環,在16 ℃下保存擴增的EGFP片段。PCR成功擴增目的片段后,取擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上擴增驗證,電泳產物通過與DNA marker比對,判斷是否擴增成功。

PCR產物回收:PCR產物經1%凝膠電泳后,在紫外燈下回收DNA目的片段,用手術刀小心地切取含目的基因片段的凝膠條帶,放入1.5 ml EP管中,即得到EGFP熒光基因片段(具體步驟參照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒所附說明書)。

1.3.3 載體雙酶切 向無菌的0.2 ml EP反應管中依次加入pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)載體5 μg;10×Buffer 5 μl;XbaⅠ和BamH Ⅰ各1.5 μl,繼續注入ddH2O補充總體積到50 μl,于37 ℃下進行酶切反應60 min。載體酶切后,進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酶切產物的回收:酶切產物經1%凝膠電泳后,在紫外燈照下,用手術刀仔細切取瓊脂糖凝膠中所需的載體條帶至1.5 ml干凈的EP管中,按照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒所附實驗步驟回收線性化的載體條帶。

1.3.4 目的片段與載體連接 使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶,連接目的基因EGFP片段與pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)酶切載體,向0.2 ml EP管中加入以下反應物:EGFP和酶切載體各100 ng;ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶2 μl;5×ClonExpress Ⅱ Buffer 4 μl,繼續加ddH2O使總體積達到20 μl,在37 ℃下進行連接反應30 min后,冰浴5 min,即得到連接產物,所得連接產物用于后續步驟。

1.3.5 感受態細胞的轉化 于冰浴中解凍混勻Stbl3感受態細胞,用移液槍從中吸取100 μl至干凈的EP反應管中,再吸取10 μl連接產物加入管中,將兩者輕輕轉動混勻,將管放入冰水中冰浴30 min,之后立即移入42 ℃水箱中水浴熱休克60 s,快速將反應管轉移至冰浴中2-3 min后將管取出,加入300 μl的LB培養基后混勻菌液,在37 ℃、200 r/min的振蕩培養箱中振蕩培養1 h,于超凈工作臺中,將菌液均勻涂布于含有Amp抗生素(100 μg/ml)的LB平板上,室溫下平放至液體吸收,倒置平板于37 ℃的生化培養箱內培養過夜。

1.3.6 陽性克隆菌落的PCR鑒定及測序 于干凈的EP管中配制菌檢PCR混合液,向管中加入菌落1 μl;上、下游引物各1 μl(引物序列見表1);TaKaRa Taq Max 10 μl;加ddH2O 7 μl定容至20 μl。配好混合液后分別加到無菌的八連管內,于超凈工作臺內,選取8個單獨的菌落,做好標記,用干凈的小槍頭,輕輕碰下平板內菌落的一邊,把粘有菌的槍頭,轉移到有混合液的管內,輕輕搖動槍頭,使菌能分散到液體中,之后棄掉槍頭。進行PCR擴增反應:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s;60 ℃退火30 s;72 ℃1min;72 ℃延伸3 min,進行25個循環,保存于16 ℃。擴增完成后,往PCR管中加入2 μl 10×loading Buffer,取10 μl樣品點樣到1%瓊脂糖凝膠中做凝膠電泳檢測,并加入5 μl Marker做參照,對照Marker大小,選取正確的菌落搖菌以備測序。將菌落PCR鑒定得到的陽性克隆,送測序公司進行質粒DNA序列檢測,測序完成后,利用Sequencher軟件比對測序結果。

1.3.7 質粒的提取及酶切鑒定 經測序驗證正確的陽性克隆,安排質粒小提,具體步驟見試劑盒說明書。配置反應液:向反應體系中加入10×Buffer 5 μl;熒光質粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP 2 μg;BamH Ⅰ和XbaⅠ各1 μl;繼續加入ddH2O將反應總體積補充到20 μl,在37 ℃下進行酶切反應20 min。取5 μl Marker和25 μl的酶切質粒樣品,經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.8 細胞培養和轉染 于37 ℃ 5% CO2的二氧化碳培養箱中培養DMEM培養液(含10 μg/ml鏈霉素,100 U/ml青霉素,10%胎牛血清)中培養HEK293細胞,待細胞密度達到80%以后將HEK293細胞轉染至LipofectamineTM2000試劑盒,具體步驟參照說明書。放置24 h后,HEK293細胞可轉染5 μg pc-DNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP DNA。

1.3.9 Western blot法檢測pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP在細胞中的表達 于48 h后收集轉染細胞中目的細胞并提取蛋白,利用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取50-80 μg的蛋白樣品,再按照比例加入上樣緩沖液,沸水浴10 min,冷卻、離心后在12%的分離膠中進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),在110 V 90 min下利用濕轉法將其電轉至PVDF膜。接著在TBST溶解的5%的脫脂奶粉和磷酸鹽緩沖液下室溫封閉1 h,4 ℃孵育一抗[單克隆抗體(1 ∶1 000),兔來源的Anti-Cdc25B單克隆抗體(1 ∶200)以及兔來源的抗β-actin]過夜,次日用TBST洗滌4遍(每次8 min),然后室溫計時2 h孵育HRP標記的二抗(鼠抗兔的單抗IgG 1 ∶5 000),最后檢測PVDF膜上蛋白的表達情況。

2 結果

2.1 熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP的構建及鑒定

EGFP目的片段與pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)載體連接,經測序公司進行質粒DNA序列檢測,結果顯示目的基因插入正確,部分測序結果見圖1。將構建好的熒光質粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP用XbaⅠ和BamH Ⅰ限制性內切酶鑒定,據瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示,觀察到的條帶位置與預期位置一致(見圖2)。目的基因EGFP條帶約位于3 300 bp,pCDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)載體條帶約位于7 000 bp,與預期相符,進一步證明基因插入正確位置,成功獲得pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP熒光表達載體,可用于體外轉錄。

圖1 pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP測序結果Figure 1 Sequencing results of pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP

M.DL10000 DNA Marker；1.pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP質粒DNA雙酶切(BamH Ⅰ和Xba Ⅰ)產物圖2 pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)雙酶切結果Figure 2 Double digestion result of pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)

2.2 熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP在HEK293細胞中的表達

通過脂質體法將擴增好的熒光質粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP轉染至HEK293細胞中,利用Western blot法檢測到,在轉染了熒光質粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP的HEK293感受態細胞中,熒光標簽-EGFP成功表達(見圖3)。證明Cdc25B突變型S15A的熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP成功構建并能夠正確表達。

1．未轉染組;2．空載體組;3．轉染3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP組圖3 3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP的HEK293細胞中的表達Figure 3 Expression of 3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP in HEK293 cells

3 討論

Cdc25B是一個高度保守的雙特異性磷酸酶,通過靶向CDK1(Cdc2)的Thr14和Tyr15來激活整個CDK1-Cyclin B復合物,從而驅動有絲分裂G2/M期的轉變[10]。Cdc25B的N端與C端間具有兩種特異性序列,分別是核定位序列和核輸出序列,它們負責調控細胞周期進程中Cdc25B在胞漿、胞核之間的穿梭,Cdc25B在細胞減數分裂啟動之前由細胞質進入細胞核,減數分裂啟動后由細胞核重新回到細胞質[11]。Cdc25B的N端參與調控微管動力學和有絲分裂進程,C端最后20個殘基具有很強的柔韌性,部分可以阻斷活性位點并與蛋白核心建立瞬態接觸[12,13]。此外,Cdc25B可受PKA的磷酸化或去磷酸化,調節其靶點CDK1的狀態,從而調控細胞周期的進程[14]。

Cdc25B磷酸酶在一些人類癌癥中高表達,包括卵巢癌、肝癌、腎癌、乳腺癌和食管鱗癌等[15-19],它參與調節細胞周期檢查點,并成為新抗癌藥物開發的可能靶點,然而,Cdc25B活性的測定方法和靶向Cdc25B的藥物篩選方法仍存在一些問題。目前測定Cdc25B磷酸酶活性常用的方法是使用對硝基苯磷酸鹽或鄰甲基熒光素磷酸鹽作為底物,但是由于這些底物是非特異性的,Cdc25B的活性經常被不準確地表達[20]。因此,Cairns等[21]開發了一種基于Western blotting的非放射性同位素測定方法,用CDK1適當地測量Cdc25B活性。在篩選抗癌藥物時,為了避免出現假陽性或假陰性的結果,利用有效的方法檢測Cdc25B的活性是必不可少的。

本課題組前期利用RNA干涉沉默Cdc25B基因后發現卵母細胞減數分裂發生阻滯,受精卵的G1期延長;但是顯微注射Cdc25B mRNA后受精卵的卵裂率明顯提高[22]。這些研究顯示了Cdc25B在細胞周期進程中的重要作用,但其作用機制尚不明確,有待進一步研究。本實驗化學合成Cdc25B突變基因S15A的熒光質粒,成功構建了熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP。利用脂質體法將構建好的pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP載體轉染至Stbl3感受態細胞,通過Western blot法檢測到Cdc25B突變基因S15A的熒光質粒成功表達。實驗中合成的S15A熒光質粒有益于接下來對Cdc25B基因的研究,有助于更合理的設計Cdc25B的配體。課題研究成果應用于農牧業,可以提高動物的繁殖數量;應用于人類生殖輔助,可以提高體外受精成功概率,縮短體外受精時間,盡早植入人體;應用于腫瘤治療,可以使腫瘤生長延緩G2期,提高腫瘤患者生存率。查閱文獻發現,目前國內外對Cdc25B的了解尚不全面,因此需更深入地探究Cdc25B在細胞中的作用機制。