大腸桿菌脂多糖誘導人乳牙牙周膜干細胞炎癥模型的建立

劉 飛,池 韻,李錦沂,王盼曦,楊克宇,郭青玉*

(1西安交通大學口腔醫院,陜西省顱頜面精準醫學研究重點實驗室,西安 710004;2西安交通大學口腔醫院兒童口腔科;3浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院口腔科;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn)

牙周膜是位于牙根周圍的一種特殊的纖維結締組織,它維系著牙齒在牙槽骨中的位置,支持其發揮咀嚼功能[1]。牙周膜中未分化的間充質細胞可根據機體需要分化為特定的細胞類型,例如成骨細胞、成牙骨質細胞、脂肪細胞等,在牙周組織的修復中起到了重要作用[2]。關于牙周膜干細胞的研究已成為口腔基礎研究中最熱門的方向之一[3]。

乳牙和恒牙具有不同的發育進程,兩者的形態、組織結構、生命周期也各不相同。當恒牙序列萌出時,乳牙的牙根吸收最終發生脫落,乳牙牙根在外界的刺激下更容易發生吸收[4,5]。有研究發現乳牙牙周膜含有成熟的干細胞,這些細胞的增殖速率、成脂分化能力、成骨分化能力等比恒牙牙周膜組織中的干細胞更強[6]。

乳牙根尖周炎是兒童口腔科的常見疾病,常伴有根分叉、根尖周區域明顯的骨質破壞。目前認為,根尖周炎是宿主防御機制與根管腔內細菌相互作用的結果。脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)廣泛分布于革蘭氏陰性菌的細胞壁中,可引起局部發熱及白細胞反應[7]。因其致病作用常用于體外炎癥模型的建立,例如RAW264.7小鼠巨噬細胞、牙齦上皮成纖維細胞及乳腺上皮細胞等[7-9]。同時,LPS也在牙髓感染、根尖周炎、牙周炎的發生發展中起了重要作用[10]。作為細菌內毒素,其對牙槽骨的吸收、牙周膜的降解都有一定的影響,在誘導體外牙周膜細胞炎性狀態中也有大量應用[11]。

本研究采用大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)LPS刺激體外培養人乳牙牙周膜干細胞(human deciduous periodontal ligament cells, hdPDLSCs),通過檢測細胞活性及炎癥因子表達,選擇合適的E.coliLPS濃度,以建立符合實驗設計需要的人乳牙根尖周炎細胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備

α-MEM培養基(Hyclone公司,美國),胎牛血清(FBS)(Gibco,美國),CD146、STRO-1、CD105、CD90、CD29、CD45、CD34抗體鼠來源單克隆抗體(Abcam,美國),E.coliLPS(Sigma,美國),反轉錄試劑盒(TAKARA,日本),ELISA試劑盒(IL-1β、IL-6、TNF-α)(聯科生物,中國)。實驗在西安交通大學口腔醫院實驗中心完成。

1.2 細胞原代培養及純化

經醫院倫理委員會批準(倫理批號:[2016]045),征得患兒家長的知情同意,采集于西安交通大學口腔醫院兒童口腔科因乳牙滯留、外傷或咬合誘導而拔除的乳牙?；颊吆Y選標準:無心臟病等全身系統性疾病,無乙肝、結核等傳染性疾病;患牙無齲壞、牙髓炎、根尖周炎等牙體及牙周相關疾病。

拔牙前使用碘伏消毒牙冠及牙齦2-3次,患牙拔除后轉移至超凈臺,取根中1/3的牙周膜,Ⅰ型膠原酶及中性酶37 ℃消化40 min,加入含20%胎牛血清的α-MEM培養基終止消化。原代細胞長出后進行首次換液,之后2-3 d換液一次。當細胞增殖至培養瓶底壁約70%時進行傳代。取第3代細胞采用連續梯度稀釋法進行純化。

1.3 細胞表面標記物檢測

取第4代對數期細胞制備細胞懸液加入1.5 ml EP管(1×106個細胞/管),分別加入直接熒光標記的小鼠抗人CD146、STRO-1、CD105、CD90、CD29、CD45、CD34抗體20 μl。避光4 ℃孵育30 min,加入300 μl無菌PBS重懸,流式細胞儀上機檢測細胞表面分子表達水平。

1.4 細胞多向分化能力檢測

將第4代對數期細胞采用成骨誘導液(含10%胎牛血清的α-MEM培養基、地塞米松10 mol/L、L-抗壞血酸50 μg/ml、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L)培養28 d后,進行茜素紅染色;采用成脂誘導液(含10%胎牛血清的α-MEM培養基、地塞米松0.25 μmol/L、吲哚美辛10 μmol/L、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5 mmol/L、L-抗壞血酸2-磷酸鹽100 μmol/L)培養28 d后,進行油紅O染色。

1.5 CCK-8檢測E. coli LPS處理后hdPDLSCs增殖活性

取第4代hdPDLSCs以2 000/孔的濃度接種96孔板,24 h后替換含不同終濃度的E.coliLPS(0,0.1,0.075,0.05,0.025,0.01 μg/ml)培養基,其中0 μg/ml為對照組。分別培養24,48,72 h后以1 ∶10的CCK-8溶液替換原液。37 ℃孵育2 h后酶標儀檢測450 nm波長處吸光度(optical density, OD值)。空白對照組為不含LPS的同種培養基,每組設5個復孔,繪制細胞生長曲線圖。

1.6 實時定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)檢測炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達

取第4代hdPDLSCs以2×105/ml的細胞濃度接種于6孔板24 h替換為含不同終濃度的E.coliLPS培養基各2 ml,其中對照組為0 μg/ml,實驗組為0.1,0.05,0.01 μg/mlE.coliLPS組,每組設3個復孔,24 h后提取RNA,進行RT-PCR檢測。RT-PCR逆轉錄體系包括:5×PrimerScript RT Master Mix 2 μl,mRNA(10 μl體系最多使用500 ng mRNA)以及RNase Free H2O(補足至10 μl體系)。RT-PCR上機反應液體系包括:SYBR Premix Taq Ⅱ 10 μl,前引物10 μmol/L 0.8 μl,后引物10 μmol/L 0.8 μl,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl,cDNA溶液2 μl,無菌蒸餾水6 μl,總計20 μl。炎癥因子引物序列見表1。

表1 炎癥因子引物序列Table 1 Sequence of inflammatory factors

1.7 ELISA檢測炎性因子蛋白表達

取第4代hdPDLSCs以2×105/ml的細胞濃度接種于6孔板24 h替換終濃度含0.05 μg/mlE.coliLPS的培養基,對照組為0 μg/ml,每組設3個復孔。24 h后離心取上清進行IL-1β、IL-6、TNF-α的ELISA檢測。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 細胞原代及傳代培養

原代培養7 d后,倒置顯微鏡下可見組織塊周圍長梭形細胞爬出,10 d后呈放射狀貼壁生長。細胞形態多為長梭形,偶可見多角形。3周后組織塊周圍細胞密集排列,覆蓋瓶底約70%。此時進行細胞傳代培養,傳代后細胞3-5 d可長至瓶底約70%,細胞形態呈長梭形(見圖1)。

A.離體乳牙 B.原代培養中hdPDLCs自組織塊游離圖1 hdPDLCs的分離培養Figure 1 Primary culture of hdPDLCs

2.2 連續梯度稀釋法純化細胞

連續梯度稀釋培養法純化細胞,倒置相差顯微鏡下挑選96孔板內單個細胞的孔,培養2周后細胞生長覆蓋孔底70%時進行傳代培養,依次接種于24孔板、6孔板擴大培養,得到純化的hdPDLSCs(見圖2)。

A.稀釋得到單個細胞 B.篩選出的單細胞形成克隆圖2 連續梯度稀釋法培養hdPDLSCsFigure 2 Culture of hdPDLSCs by serial dilution culture method

2.3 hdPDLSCs的鑒定

流式細胞儀檢測細胞表面標記物,顯示hdPDLSCs高表達間充質干細胞早期標志物CD146(67.05%)和STRO-1(99.85%),高表達間充質干細胞表面標志物CD105(99.94%)、CD90(100%)和CD29(100%),低表達血管內皮細胞表面標志物CD45(1.72%)和CD34(0.31%,見圖3)。實驗結果表明,培養的hdPDLSCs符合間充質干細胞表面標記的表達。

圖3 hdPDLSCs表面標志物檢測Figure 3 Identification of cell surface markers of hdPDLSCs

成骨誘導28 d,茜素紅染色后發現,hdPDLSCs誘導后形成密度、大小不一的紅色礦化結節,礦化結節呈同心圓狀(見圖4A,B)。成脂誘導28 d,油紅O染色后發現,hdPDLSCs誘導后形成油紅O陽性的串珠狀脂肪小滴,脂滴聚集呈簇狀(見圖4C)。

A.成骨分化 B.礦化結節 C.成脂分化圖4 hdPDLSCs多向分化能力檢測Figure 4 Multidirectional differentiation ability test of hdPDLSCs

2.4 不同濃度E. coli LPS處理后的細胞增殖活性的變化

0-72 h內6組細胞的OD值隨時間的延長均顯著增高(P<0.05)。0.1,0.075 μg/ml LPS分別刺激24,48,72 h時,OD值較對照組顯著降低(P<0.05);0.05,0.025,0.01 μg/ml LPS分別刺激24,48,72 h時,OD值與對照組相比未見明顯差異。因此可認為當LPS濃度0.075-<0.1 μg/ml時,對hdPDLSCs增殖活性有顯著的抑制作用;當LPS濃度小于0.05 μg/ml時,對細胞的增殖活性無明顯影響(見圖5)。E.coliLPS作用24 h即可引起OD值的顯著變化,且LPS刺激0-72 h可維持OD值相同的變化趨勢;當LPS的濃度小于等于0.05 μg/ml時,細胞的增殖不受影響(見圖5)。因此選擇0.05 μg/ml的LPS刺激hdPDLCs 24 h進行后續的實驗。

同濃度與24 h組相比,*P<0.05;同時間與0 μg/ml相比,#P<0.05圖5 CCK-8檢測hdPDLSCs在不同濃度的E. coli LPS刺激下的增殖活性Figure 5 Proliferation of hdPDLSCs stimulated by different concentrations of E. coli LPS

2.5 不同濃度E. coli LPS處理后的細胞炎癥因子表達的變化

2.5.1E.coliLPS刺激下炎性因子mRNA水平表達的改變 real-time PCR結果顯示,0.01,0.025,0.05 μg/ml組IL-1β的mRNA表達的水平均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05),且0.05 μg/ml組IL-1β的mRNA表達水平顯著高于0.01 μg/ml組和0.025 μg/ml組(P<0.05)。0.01,0.025,0.05 μg/ml組IL-6的mRNA表達的水平均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05),且0.05 μg/ml組IL-6的mRNA表達水平顯著高于0.01 μg/ml組(P<0.05)。0.01,0.025,0.05 μg/ml組TNF-α的mRNA表達的水平均顯著高于0 μg/ml組(P<0.05),且0.05 μg/ml組及0.025 μg/ml組TNF-α的mRNA表達水平顯著高于0.01 μg/ml組(P<0.05,見圖6)。即隨著LPS濃度的升高,炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達逐漸升高。

與0 μg/ml組相比,*P<0.05;與0.01 μg/ml組相比,#P<0.05;與0.025 μg/ml組相比,&P<0.05圖6 hdPDLSCs在不同濃度E. coli LPS刺激下IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的變化Figure 6 The mRNA levels of IL-1β, IL-6,TNF-α in hdPDLSCs stimulated by different concentrations of E. coli LPS

2.5.2E.coliLPS刺激下炎性因子蛋白水平表達的改變 ELISA結果顯示,對照組細胞上清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量較低。與對照組相比較,0.05 μg/ml的E.coliLPS刺激hdPDLSCs 24 h后,細胞上清中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05,見圖7)。

與對照組相比,*P<0.05圖7 hdPDLSCs在E. coli LPS刺激下炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白分泌變化Figure 7 Protein levels of IL-1β, IL-6,TNF-α in hdPDLSCs stimulated by E. coli LPS

3 討論

進行牙周膜細胞的體外培養時,牙周膜細胞的分離培養一直是限制研究進行的重要步驟之一。傳統的牙周膜細胞原代培養方法分為酶解法和組織塊消化法兩種常規方法。有學者[12]結合兩種原代培養方式的優點,總結出酶解組織塊法,Ⅰ型膠原酶處理組織塊后,將組織塊固定于壁底,4 h后翻轉培養瓶使培養基浸潤組織塊,可以取得更好的原代培養成功率。本實驗發現采用酶解法結合組織塊法可提高hdPDLCs原代培養的成功率。為了分離得到乳牙的牙周膜干細胞,需要對培養得到的原代細胞進行單克隆篩選。此法在一塊96孔板中完成細胞的梯度稀釋,節約了細胞用量,可以得到分離的單細胞進行后續培養。

牙周膜組織中含有多種細胞成分,需進行干細胞的表型鑒定及多向分化能力進行驗證[13]。但目前尚無公認的鑒定標志物進行牙周膜干細胞的生物學特征鑒定。在不同研究中,采用的鑒定指標各不相同[13,14]。有的研究采用單一指標進行檢驗,也有采用多項指標進行綜合鑒定。常用的陽性標志物包括:CD146、CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、STRO-1等,常用的陰性指標包括CD45、CD34等[14]。本實驗綜合多位學者的研究,對間充質干細胞早期標志物CD146、STRO-1,間充質干細胞表面標志物CD105、CD90、CD29,血管內皮細胞表面標志物CD45、CD34進行檢測。流式細胞術檢測結果表明培養的hdPDLSCs是間充質細胞來源,經誘導后具有多向分化的潛能,可用于后續的試驗研究。

以往學者進行牙周膜干細胞的炎癥誘導時,使用的LPS濃度各不相同。Andrukhov等[15]在研究E.coliLPS對人恒牙牙周膜干細胞炎癥效應的影響時,選擇1 μg/ml的濃度來刺激細胞;J?nsson等[16]在研究LPS對牙周膜干細胞IL-8及MCP-1表達水平的影響時,選擇0.5 μg/ml的濃度為工作濃度;Kukolj等[17]則選擇了E.coliLPS 0.1-10 μg/ml作為炎癥誘導工作濃度;Li等[18]使用0.1 μg/ml的E.coliLPS誘導牙周膜干細進行研究;楊芳等[19]在研究LPS對人牙周膜干細胞的炎癥及骨穩態效應影響的實驗中,比較了不同濃度LPS對人牙周膜干細胞IL-1β表達的促進作用,最終選擇了1 μg/ml作為其刺激濃度;還有學者使用10 μg/ml作為炎癥誘導的工作濃度。可見對于LPS誘導牙周膜干細胞炎癥狀態時,LPS的工作濃度仍存在爭議。結合前人的研究,LPS的濃度選擇需要考慮兩方面的內容:LPS的刺激對細胞的活性沒有明顯的抑制作用,并且細胞能表現出炎癥的狀態。上述研究結果均以人恒牙牙周膜干細胞作為研究對象,尚無對炎癥hdPDLSCs的探索。因此本實驗設置了0-0.1 μg/ml的LPS濃度梯度,發現在0.01-0.05 μg/ml的濃度范圍內,LPS對于細胞活性沒有明顯的影響,而超過0.075 μg/ml后,LPS對細胞增殖活性存在明顯的抑制作用(P<0.05)。

乳牙生理性牙根吸收的過程中,炎癥相關因子IL-1、IL-6和TNF-α的表達增多。hdPDLSCs通過調節炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α的表達以及調節成骨、破骨相關因子的表達,進而促進了破骨細胞的活化成熟以致乳牙發生生理性根吸收。IL-1、IL-6和TNF-α還可以作用于破骨細胞及其前體細胞直接發揮作用。本實驗發現在0.05 μg/ml的濃度下,不僅IL-1β、TNF-α這兩種關鍵炎性因子的表達受到明顯促進,其他炎癥相關因子如IL-6的表達也有明顯地提高(P<0.05)。因此0.05 μg/ml的E.coliLPS可作為誘導hdPDLSCs炎癥模型的適宜濃度。