GO-PEEK復合材料的骨誘導功能

張琳梅,張耀超,左艷萍,梁 斌

(1西安醫學院口腔醫學院口腔解剖生理學教研室,西安 710021;2西安醫學院口腔醫學院口腔修復學教研室;3西安醫學院口腔醫學院口腔組織病理學教研室;*通訊作者,E-mail:2111422131@qq.com)

由頜面部外傷、腫瘤等疾病引起的下頜骨缺損將會導致患者咀嚼、言語、吞咽和呼吸功能障礙,嚴重影響患者生活質量。近年來,生理重建技術有了很大的提高,隨之涌現出了大批具有良好組織相容性的生物重建材料。鈦金屬及其合金材料因其優異的耐蝕性能、機械強度以及組織細胞相容性,成為目前整形外科以及口腔界最受歡迎的生物替代材料[1]。然而,在臨床工作中嚴重的術后并發癥如骨溶解、過敏反應、植入物松動以及最后的植入失敗都有可能發生[2]。為了克服這些金屬植入物的臨床限制性,盡量減少植入后生物反應的負面影響,尋找金屬的有效替代品也是亟待突破的重點問題。

聚醚醚酮(polyetheretherketone,PEEK)是一種聚芳半結晶熱塑性聚合物,其分子結構為(-C6H4-O-C6H4-O-C6H4-CO-)n[3]。PEEK材料在醫學中的應用主要常見于外科領域。從加工的角度來看,PEEK材料可以通過傳統的塑料加工獲得,反復消毒和加熱可制作出個性化的輪廓,以適應于相應的骨骼形狀[4]。然而,因為缺乏初期直接骨沉積和后期骨結合的能力,它在重建后的骨承重方面的應用是有限的[5]。

氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯家族中最重要的衍生物之一,GO通過疏水性和靜電作用顯著改善與蛋白質的相互影響,并有可能潛在地增強干細胞的成骨分化[6]。盡管如此,納米材料自身的毒性還是引起了廣泛的爭議。將GO結合在無毒副作用的基質上,可以限制其流動性,從而使控制細胞毒性降到可接受的水平以下[7]。已有研究證實GO基平面擁有較多的π鍵結合結構,它可以與PEEK材料中的π鍵形成強大而穩定的π-π結合[8]。然而通過文獻研究發現,利用GO作為表面涂層應用在PEEK中是否具有更強的成骨活性并沒有相應的深入研究。

本研究設想通過3D打印PEEK仿下頜骨多孔支架,利用GO修飾表面,通過成骨相關指標檢測復合支架的生物性能及成骨性能,初步探索GO-PEEK復合材料在細胞外基質中的骨誘導功能。為GO-PEEK作為一種新型的具有良好抗菌性能及成骨能力的下頜骨缺損修復材料提供理論依據,以進一步拓寬骨組織工程在頜面部骨缺損領域的應用。

1 材料和方法

1.1 實驗設計及分組

為了增加支架表面的微孔結構,研究組首先對3D打印PEEK仿下頜骨支架進行硫化處理,形成S-PEEK支架。繼而通過將S-PEEK支架與GO(氧化石墨烯)混合,以達到GO充分結合支架,優化骨誘導能力以及材料本身抗菌性能的目的,從而制備GO-PEEK支架。根據骨髓間充質細胞接種于PEEK、S-PEEK、GO-PEEK不同支架表面,實驗分為:空白對照組(僅接種骨髓間充質干細胞,無支架)、PEEK組(骨髓間充質干細胞+PEEK支架4枚)、S-PEEK組(骨髓間充質干細胞+硫化PEEK支架4枚)、GO-PEEK組(骨髓間充質干細胞+氧化石墨烯PEEK支架4枚)。采用CCK、RT-PCT等檢測方法考察研究不同支架對骨髓間充質干細胞的物學性能及成骨相關基因:Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、Ⅰ型膠原蛋白α1(collagen type Ⅰ alpha 1,COLLA1)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)的表達情況的影響。

1.2 實驗材料

細胞及PEEK支架;骨髓間充質細胞(提取自SD大鼠下頜骨);PEEK支架(由西安交通大學快速制造國家工程研究中心經3D打印獲得)。FTC-3000TM System(Funglyn生物公司,加拿大);正反向引物及測序引物合成(上海生工生物有限公司);DEPC純水(ABI公司,美國);低溫高速離心機(5810R,Eppendorf公司,美國);UV3000紫外可見分光光度儀(島津,日本);擴增儀(9700NA,MJ公司,美國);無核酸酶離心管(Eppendorf,EP,先鋒生物科技有限公司);氯仿,75%乙醇,異丙醇,98%硫酸,丙酮(西安交通大學醫學院設備科);裂解液(Trizol,Invitrogen,美國);PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa,美國);SYBR Premix Ex(TaKaRa,美國);干細胞培養基(MesenPRO RSTMMedium,Gibco,USA);恒溫孵育箱(RC03000T-5-VBC-C02,Therono Electron Corporation);96孔板;烤箱(西安交通大學醫學院設備科);圖像信號采集及處理系統(Q550CW,Leica公司,德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 3D打印PEEK仿下頜骨微孔支架 采用西安市中心醫院影像中心Philipsi CT對健康成年人下頜骨進行薄層CT掃描。掃描參數為:厚度0.625 mm;像素0.580 mm;電壓120 kV;單位時間射線量240 mAs;無間隙容積掃描。受試者取仰臥位、張口位(上下牙列分離);眶耳平面與水平面垂直;掃描平面垂直于眶耳平面。掃描范圍:全顱骨。所獲掃描數據以DICOM 3.0儲存。將CT掃描的原始DICOM數據導入Mimics 16.0。所有數據轉交于西安交通大學快速制造國家工程研究中心,由相關技術人員提取下頜骨松質骨相關數據,并運用醫療級PEEK材料進行3D打印,最終形成2 mm×2 mm×2 mm標準微孔支架。

1.3.2 樣本制備 3D打印的的PEEK支架均使用丙酮、乙醇、蒸餾水超聲波洗滌。室溫下,部分PEEK支架采用98%的硫酸進行硫化處理5 min,為了獲得均勻的多孔結構,整個過程中均使用超聲攪拌。隨后將樣品取出并浸入丙酮中,攪拌10 min,去除表面殘留。之后,樣本在蒸餾水中超聲波清洗10 min。重復3次,最后標本在烤箱60 ℃烤干作為S-PEEK組支架備用。超聲波振動將5 mg的GO分散到50 ml蒸餾水中4 h,形成均勻的GO懸浮液。部分S-PEEK支架浸泡在GO混懸液中10 min。浸泡之后,支架于烤箱中100 ℃烤干10 min。上述過程重復5次,以確保S-PEEK支架所有微孔隙均被GO覆蓋。最后將樣本置于60 ℃烤箱過夜,留作GO-PEEK組支架備用。

1.3.3 SD大鼠下頜骨骨髓間充質細胞提取 選擇6-8周齡SPF級雄性SD大鼠,體質量約350-400 g(西安交通大學醫學部動物實驗中心)。經4%水合氯醛腹腔麻醉后處死,75%酒精浸泡消毒,無菌條件下解剖雙側下頜骨后浸泡在1%青鏈霉素PBS中。紫外光下靜置30 min,倒掉PBS,再次沖洗3次。去除下頜骨雙側骨骺,暴露骨髓腔。隨后用干細胞培養基反復沖洗骨髓腔,并將其移至含MesenPRO RSTMMedium培養瓶中,37 ℃,5% CO2培養箱中培養。

1.3.4 細胞培養 提前24 h將PEEK支架、S-PEEK支架、GO-PEEK支架置于超凈臺中紫外照射。實驗當天用滅菌鑷,分別將不同處理支架放置于6孔板中。骨髓間充質細胞計數,以每孔1.2×106個細胞濃度接種于不同分組支架表面?？瞻讓φ战M僅接種骨髓間充質干細胞。

1.3.5 CCK-8檢測細胞生物學活性 通過測定細胞增殖,探究空白對照組、PEEK支架組、S-PEEK組、GO-PEEK組中不同支架對下頜骨間充質干細胞生存狀態的影響。按照1.3.4細胞培養的方法,骨髓間充質細胞培養第1天后,經0.25%胰酶消化,細胞計數,以每孔5×104個細胞濃度按不同分組鋪96孔板。培養24,48,72 h向每孔加入10 μl CCK-8溶液,再次孵育4 h,使用酶標儀測定在450 nm處的吸光度,吸光度值越高,細胞活性越高。

1.3.6 RNA提取 按照1.3.4細胞培養的方法，細胞培養第5天后，分別收集不同分組的細胞，加入1 ml的Trizol液，室溫放置10 min；隨后轉移至1.5 ml EP管中，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；將混懸液上清轉移至無菌無酶EP管，加入200 μl氯仿，震蕩15 s，室溫下靜置2-3 min；混懸液12 000 r/min，4 ℃離心15 min；吸取上層水相于新的無菌無酶EP管中，加入500 μl異丙醇，室溫靜置10 min；混合液12 000 r/min，4 ℃離心10 min；離心完畢后棄上清，加入1 ml含有75%乙醇，吹起位于底部的沉淀后7 500 r/min，4 ℃離心5 min；離心完畢后棄上清，EP管室溫放置干燥10 min。EP管內完全干燥后加入30 μl無核酸酶水(Diethyl pyrocarbonate，DEPC)，離心1 min，55-60 ℃水浴溶解RNA。分光光度儀檢測RNA濃度，一般A260/A280在1.8-2.0，A260/A230在1.9-2.1為宜。

1.3.7 qRT-PCR檢測成骨相關基因RUNX2、OOLA1、OCN表達情況 設計與成骨相關基因的上下游引物。按照1.3.4的細胞培養方法,培養第2天后,Trizol法提取RNA。經過逆轉錄、RT-PCR分別檢測與成骨密切相關的Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、Ⅰ型膠原蛋白α1(collagen type Ⅰ alpha 1,COLLA1)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)的表達情況,β-actin作為內參對照。qRT-PCR實驗所得數據運用2-ΔΔCt公式計算。反應條件為:首先95 ℃,30 s;接著95 ℃,5 s→60 ℃,30 s,40個循環。引物設計見表1。

表1 RUNX2、COLLA1、OCN引物序列Table 1 Primer sequences of RUNX2, COLLA1 and OCN

1.4 統計學分析

qRT-PCR實驗所得數據運用2-ΔΔCt公式計算。數據統計分析選用獨立樣本t檢驗。CCK-8實驗所得數據通過雙因素方差分析(two-way ANOVA)進行統計分析。所有結果重復3次。Graph Pad Prism 6軟件進行繪圖。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同支架材料對骨髓間充質干細胞活性的影響

2.1.1 PEEK材料抑制骨髓間充質干細胞活性 與空白對照組相比,PEEK組間充質干細胞接種于PEEK材料24 h,未見明顯細胞增殖差異;當繼續培養至48 h,細胞活性顯著下降(P<0.01),出現細胞死亡現象(見圖1)。

2.1.2 S-PEEK材料抑制骨髓間充質干細胞活性 與空白對照組相比,S-PEEK組培養24 h,即發生細胞活性降低趨勢,少量細胞死亡現象,差異無統計學意義。當繼續培養至48 h,細胞活性顯著下降(P<0.01),出現大量細胞細胞死亡現象。與PEEK組相比,S-PEEK組S-PEEK培養至24 h時,出現細胞活性降低趨勢,72 h細胞活性顯著降低(P<0.01,見圖2)。

2.1.3 GO-PEEK支架材料促進骨髓間充質干細胞活性 與空白對照組相比,GO-PEEK組培養24 h,細胞活性出現增長。自24 h后間充質細胞活性出現逐漸增長趨勢。48 h及72 h均出現骨髓間充質細胞活性增長,差異具有統計學意義(P<0.01,見圖3)。

與空白對照組比較,**P<0.01圖3 CCK-8檢測GO-PEEK支架表面間充質干細胞活性Figure 3 The proliferation of mesenchymal stem cells on the surface of GO-PEEK by CCK-8

2.2 不同支架材料對骨髓間充質干細胞成骨相關因子的影響

與空白對照組相比,PEEK組骨髓間充質干細胞RUNX2基因在mRNA水平表達量降低(P=0.018);S-PEEK組骨髓間充質干細胞RUNX2基因在mRNA水平表達量亦降低(P<0.01);GO-PEEK組RUNX2基因在mRNA水平表達量增高(P<0.01,見圖4)。

實驗結果顯示:與空白對照相比,間充質干細胞與PEEK支架共培養后,COLLA1基因在mRNA水平表達下調未見明顯差異;而與S-PEEK支架共培養后,出現表達量下調(P<0.01);與GO-PEEK共培養后,COLLA1基因在mRNA水平表達量增高(P<0.01,見圖4)。

相比較于空白對照組,PEEK組及S-PEEK組OCN基因表達量呈下調趨勢,S-PEEK組明顯下調(P<0.01);而GO-PEEK組OCN基因在mRNA水平表達量增高,差異有統計學意義(P<0.01,見圖4)。

3 討論

聚醚醚酮是一種聚芳半結晶熱塑性聚合物,其分子結構為(—C6H4—O—C6H4—O—C6H4—CO—)n[3]。其物理性質如下:①水溶性(室溫下)是0.5%(W/W)[5];②除98%的硫酸外,不溶于任何傳統溶劑[9];③彈性模量約為3-4 GPa,與人類骨密質(7-30 GPa)相比略顯不足[4];④具有較好的熱性能,在體內有較強的穩定性[3]。除了這些優良特性外,PEEK材料還具有良好的耐化學腐蝕性能、無毒性、天然的輻射透射性能和磁共振成像兼容性等[10]。由此可知,PEEK材料在顱頜面重建中的應用無可非議,然而,因為缺乏初期直接骨沉積和后期骨結合的能力,它在重建后的骨承重方面的應用是有限的[5]。同樣,PEEK材料的生物惰性以及較差的抗菌性也在很大程度上限制了其在臨床工作中的應用[11]。研究提示RUNX2是調控成骨細胞、促進骨性形成的關鍵性調控因子[12],COL1A1型膠原蛋白是骨骼、皮膚和肌腱等許多人體組織中最豐富的膠原蛋白。COL1A1基因的功能喪失與成骨不全癥(脆骨病)密切相關[13]。OCN骨鈣蛋白是成骨的主要標記物[14]。本研究通過在PEEK組檢測上述基因表達情況,結果發現,將SD大鼠下頜骨骨髓間充質干細胞與PEEK材料共培養時,細胞的增殖能力逐漸減弱,與無支架培養的對照組相比較,成骨相關基因RUNX2、COL1A1、OCN的表達量下調(P<0.05)。說明PEEK材料本身不利于促進骨組織在材料表面沉積及形成穩定的骨結合。這可能與其自身生物惰性、較差的抗菌性以及支架本身表面缺乏微空隙結構,不利于細胞沉積密切相關。

為了增加PEEK材料周圍骨組織的沉積以及生物學性能,可以采用表面結構改性或進行生物活性物質表面涂層等方法[15,16]。經過改性的PEEK復合材料在一定程度上提高了單一PEEK材料的彈性模量,促使其近似于皮質骨(18 GPa),在一定程度優化了其骨誘導能力以及材料本身抗菌性能。本研究通過用氧化石墨烯混懸液(GO)處理PEEK支架,形成GO-PEEK復合支架,并在此基礎上研究其生物學性能及成骨性能。但是由于PEEK材料為惰性材料,很難在其表面形成理想的微孔隙結構,GO混懸液的附著率及后期成骨雖仍不盡人意。有一種提高PEEK材料骨結合能力的方法例如在其表面增添孔隙結構,多孔的表面結構能顯著促進軟硬組織的生長,從而創造了更多的生物錨定,以此提高植入物的穩定性[17]。研究認為,應用于金屬表面的微孔隙結構包括噴砂[18]、微弧氧化[19]、陽極氧化[20]、酸蝕[21]以及堿處理[22]。但是大量硫官能團產生的硫化作用直接導致細胞中DNA的損傷[23]。有學者研究發現,經過濃硫酸處理的PEEK材料表面可形成理想的網絡微孔隙,這種結構在體外能更好地促進細胞黏附、細胞增殖、骨分化且大幅增強骨整合和骨植入物在體內的結合強度[24]。因此本研究采用98%濃硫酸酸化處理PEEK支架(S-PEEK),改善PEEK材料自身的不足,促使其結構更趨近于下頜骨的篩狀結構,從而在一定程度促進GO混懸液的附著率;后期成骨能力;改善其細胞損傷、抗菌性能不足等劣勢。實驗結果發現S-PEEK支架具有比PEEK支架更明顯的細胞毒性作用,附著在其中的骨髓間充質干細胞生物學活性明顯降低(P<0.01),成骨能力幾乎為零。推測可能與S-PEEK支架表面殘留的酸性物質,直接導致細胞中DNA的損傷相關。

氧化石墨烯含有sp2雜化碳原子,并且具有大量的活性氧官能團[25]。GO通過疏水性和靜電作用顯著改善與蛋白質的相互影響,并有可能潛在地增強干細胞的成骨分化[6]。此外,GO納米片對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌表現出明顯的抗菌能力[26]。因此,GO廣泛應用于生物傳感器、細胞成像、納米探針、藥物傳遞和組織工程等生物技術和生物醫學領域[27,28]。但是,GO生物反應的變化取決于其層數、剛度、疏水性、表面功能化、劑量、靶細胞中活性氧的生成以及GO極高的疏水性表面均可能導致直接的物理毒性或生物分子的吸附作用引起間接毒性。有研究表明[8]:GO溶液比GO涂層具有更高的毒性,因為GO的粗糙邊緣可以穿透細胞膜,破壞正常的細胞功能。因此,將GO結合在無毒副作用的基質上,可以限制其流動性(從而避免其與細胞之間不必要的相互作用),以此可調整GO尺寸,從而使控制細胞毒性降到可接受的水平以下。本實驗研究通過GO溶液充分覆蓋在經酸化的多孔PEEK支架表面(GO-PEEK),結果發現:將SD大鼠下頜骨骨髓間充質干細胞與GO-PEEK材料共培養時,細胞的增殖能力增強(P<0.01),與PEEK和S-PEEK支架材料相比較,成骨相關基因RUNX2、COL1A1、OCN的表達量顯著升高(P<0.01)。

以上結果表明:GO-PEEK復合支架在一定程度上改善了PEEK自身的生物惰性、較差的抗菌性、缺乏初期直接骨沉積和后期骨結合的能力;中和優化了因為S-PEEK支架表面殘留的酸性物質直接導致的細胞DNA損傷;優化了GO本身極高的疏水性表面導致的直接物理毒性和生物分子吸附作用引起地間接細胞毒性。GO-PEEK對間充質干細胞的成骨相關有一定促進作用。是一種新型的具有良好抗菌性能及成骨能力的下頜骨缺損修復材料,最終可拓寬骨組織工程在頜面部骨缺損領域的應用。