染色體核型分析聯合BACs-on-Beads技術在產前診斷中的應用

趙淑慧,高云鴿,錢羅蒙,翟梁好,董 健,李春艷#,陳必良*

(1空軍軍醫大學西京醫院婦產科,西安 710032;2白銀市中心醫院產科;*通訊作者,E-mail:cblxjh@fmmu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:lichunyanangel@163.com)

出生缺陷是指嬰兒出生前發生的身體結構、功能或代謝異常。隨著我國二孩政策的開放，高齡孕產婦的數量不斷增加，出生缺陷的生育風險也在不斷增加。在我國每年約有90萬例新生兒發生出生缺陷，已成為重要的公共衛生問題。產前篩查及產前診斷技術是預防出生缺陷的主要措施。產前超聲能夠及時有效地發現胎兒結構異常[1]。染色體異常的篩查方法主要包括血清學篩查和無創產前基因檢測(noninvasive prenatal test,NIPT)，產前診斷方法主要包括染色體核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)和細菌人工染色體標記-微球鑒別/分離法(BACs-on-Beads，BoBs)檢測等[2]。染色體核型分析是產前診斷胎兒染色體異常的金標準[3]。產前BACs-on-Beads是專門針對人類最常見的染色體疾病進行靶向檢測的最新技術，除了能檢測13，18，21，X和Y 5種主要的染色體變化外，還可以檢測9種常見微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征、DiGeorge綜合征、Angelman綜合征、Prader-Willi綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征)。本文對2 115份胎兒羊水進行BoBs檢測和染色體核型分析，評估染色體核型分析聯合BoBs技術在產前對胎兒染色體異常診斷的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年1月至2020年7月在西京醫院產前診斷中心接受遺傳咨詢并進行羊水穿刺的2 115例孕婦,年齡(30.32±5.07)歲,孕周(21.34±3.46)周。納入標準：①具備產前診斷的指征；②同時接受染色體核型分析和BoBs檢測。排除標準：染色體核型分析和BoBs檢測二者僅進行其一或其中一項檢測失敗。孕婦的產前診斷指征包括：年齡≥35歲；血清學篩查高風險；胎兒超聲結構異常；無創DNA產前檢測(NIPT)高風險；不良孕產史；其他(家族遺傳病史夫妻一方染色體異常不良接觸史等)。所有孕婦均簽署產前診斷知情同意書。本研究已通過倫理委員會審批(S2016-120-02)。

1.2 研究方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 囑孕婦排空膀胱，仰臥位，腹部穿刺部位常規消毒，超聲持續引導下行羊膜腔穿刺術，抽取羊水30 ml，20 ml用于G顯帶核型分析，10 ml用于BoBs檢測。

1.2.2 染色體核型分析 將20 ml羊水在無菌操作下進行培養、消化、離心，常規染色體制片、G顯帶，每例樣本分析30個分裂相，采集3-5個核型圖。發現染色體異常或多態性時,增加分析的核型數。

1.2.3 胎兒羊水BoBs檢測 取10 ml羊水，根據DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen,USA)說明書方法提取樣本DNA。利用Prenatal BoBsTM試劑盒(PerkinElmer,USA)進行樣本檢測，luminex200TM讀取信號強度，BoBsoft2.0軟件進行結果分析。

2 結果

2.1 胎兒染色體核型分析與產前BoBs檢測結果

BoBs和核型分析均對胎兒樣本檢測成功。2 115例羊水樣本中，核型分析檢測出49例染色體異常，檢出率2.32%,包括13-三體綜合征1例、18-三體綜合征4例、21-三體綜合征20例、超雌綜合征2例、特納綜合征2例、染色體微缺失/微重復4例、性染色體嵌合體2例、易位5例、倒位7例以及Rob易位2例；BoBs檢測出31例染色體非整倍體和19例染色體微缺失/微重復綜合征(見表1),檢出率2.36%。染色體核型分析檢出2例性染色體嵌合體，BoBs檢出2例性染色體嵌合體，但其中1例嵌合體兩種方法均檢測出，故兩種方法共檢測出3例染色體嵌合體病例。

表1 2 115例胎兒染色體核型分析與產前BoBs檢測結果對比Table 1 Comparison of chromosome karyotype analysis and prenatal BoBs test results in 2 115 fetuses

2.2 微缺失/微重復綜合征19例染色體核型對比

BoBs技術檢測出19例染色體微缺失/微重復綜合征，包括FMR1(Xq27.3缺失)1例、Williams-Beuren綜合征(7q11.2擴增)1例、Digeorge綜合征Ⅰ型(22q11.2缺失)1例、Larger-Giedion綜合征(8q23.3缺失)1例、Kallmann綜合征(XP22.31缺失)3例、Wolf-Hirschhorn綜合征(4p16.3缺失)1例、AZFb+c微缺失(yq11.223q11.23缺失)11例，而染色體核型分析僅檢測出1例Williams-Beuren綜合征、1例FMR1和1例Larger-Giedion綜合征(見表2)。其中Williams-Beuren綜合征、Digeorge綜合征Ⅰ型、Larger-Giedion綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征為常見的微缺失綜合征。

表2 微缺失/微重復綜合征19例染色體核型對比Table 2 Comparison of karyotype in 19 cases of microdeletion/microduplication syndrome

3 討論

產前診斷是降低出生缺陷的有效辦法，對優生優育具有重要意義。染色體核型分析能夠發現染色體數目異常及大于5-10 Mb的結構異常，是產前診斷的“金標準”，但該方法存在細胞培養耗時長、分辨率低、耗費大量人力等缺點，且對大部分與畸形或智力發育相關的微缺失、微重復的檢測能力有限[4]，因此存在漏診風險。CMA技術包括分析單核苷酸多態性并比較基因組雜交的微陣列，不僅能檢測到染色體非整倍體異常，還能檢測到微缺失/微重復片段[5]。目前，國內外指南推薦當產前超聲提示胎兒結構異常時，首先選擇CMA進行遺傳學檢測[6,7]。有研究表明[8]，染色體核型分析聯合CMA技術檢測嵌合體對產前診斷和適當的遺傳咨詢提供更全面、更準確的篩查具有重要意義。但該技術在檢測致病性的染色體拷貝數異常的同時，也能檢測到一些意義不明的染色體拷貝數異常(VOUS)，對結果判讀及遺傳咨詢增加難度[9]，且費用較高，對孕產婦的經濟壓力較大。產前BoBs技術的應用彌補了傳統染色體核型分析的不足之處，并具有以下優勢：無需細胞培養、只需低劑量的DNA就能完成檢測、通量高可以實現多個樣本同時檢測，而且報告周期短、結果明確易解讀[10]。與其他方法相比，BoBs技術在快速產前診斷中具有明顯優勢。推薦染色體微陣列分析為產前超聲異常胎兒遺傳學檢測的首選診斷方法。

本研究應用“核型分析+BoBs檢測”產前診斷模式對2 115例羊水樣本進行核型分析及BoBs檢測，2 066例羊水樣本染色體核型分析結果顯示為正常，2 065例羊水樣本BoBs檢測結果顯示正常。BoBs在檢測染色體數目異常時與傳統的核型分析結果一致，均能檢出29例胎兒染色體數目異常，符合率為100%，與其他報道相同[11]。在本研究中，產前BoBs檢測出50例染色體異常，檢出率為2.36%；染色體核型分析檢測出染色體異常49例，檢出率為2.31%；兩種方法聯合檢出65例染色體異常，檢出率為3.07%。由此可見，“核型分析+BoBs檢測”產前診斷模式檢出率均高于兩種方法單獨應用，降低了漏診風險。

本研究結果顯示，在19例染色體微缺失/微重復病例中，核型分析僅檢測出4例，而BoBs均檢測成功，兩者檢測符合率為15.8%。BoBs不僅檢測出常見的9例微缺失/微重復綜合征，此次研究還檢測到3例Kallmann綜合征以及11例AZFb+c微缺失。據文獻報道[12]，Kallmann綜合征是一種伴有嗅覺缺失或減退的低促性腺激素型遺傳性疾病，可伴有唇裂、腭裂、掌骨短及腎臟發育異常。AZFb+c微缺失臨床表現為精子生成障礙、少精癥，可能導致生育性下降或不育[13]。雖然這兩種微缺失綜合征不會引起致命性缺陷，但對新生兒出生后的診療具有指導作用。以上結果體現了BoBs檢測技術在微缺失/微重復綜合征產前診斷中的獨特優勢，彌補了染色體核型分析的局限性，拓寬了產前診斷技術對染色體異常的檢測范圍，避免了常見的微缺失綜合征患兒的出生，降低了出生缺陷。

回顧類似研究的相關文獻，王穎等[14]采用BoBs與常規核型分析對190例孕婦羊水樣本進行檢測，評估兩種方法單獨和聯合使用在高危孕婦產前診斷的臨床價值。結果顯示，BoBs及核型分析染色體異常檢出率分別為7.37%和6.84%，兩種方法聯合使用后染色體異常檢查率為9.47%。另一項研究[15]對1 409例染色體異常高危因素孕婦進行BoBs檢測和核型分析，并對染色體異常結果通過CMA或FISH驗證。結果表明，BoBs能夠快速檢測到染色體非整倍性。此外，能夠檢測核型分析漏診的微缺失/微重復病例。雖然以上研究的染色體異常檢出率比本研究染色體異常的檢出率高，這可能是本研究樣本量較大造成，但是兩個研究得到的結論相同，即兩種方法聯合使用比單獨使用檢測到更多的胎兒染色體異常。

BoBs檢測技術也存在一定的局限性，例如無法檢測出易位、倒位及低比例的嵌合體等。在本研究中，3例染色體嵌合樣本中，傳統染色體核型分析和BoBs分別檢測出2例嵌合，其中1例為共同檢出。核型分析額外檢測出被BoBs漏檢的15例染色體異常，分別為平衡易位5例、倒位7例、羅伯遜易位2例，導致BoBs漏檢的原因可能是探針未覆蓋到發生易位和倒位的染色體區域。另外，BoBs因嵌合體比例較低而出現假陰性結果。因此產前BoBs技術與核型分析聯合應用能夠有效避免單一技術造成的染色體病的漏診。

綜上所述，核型分析與BoBs檢測均能檢出染色體數目異常，BoBs在檢測染色體微缺失和微重復方面具有更明顯的優勢，同時縮短了報告周期，有利于減輕孕婦及其家屬的焦慮情緒。我們認為，傳統染色體核型分析聯合BoBs技術進行產前診斷，可以提高胎兒染色體異常的檢出率，降低染色體異常的漏診，為出生缺陷的預防起到關鍵作用。