超高壓輔助提取藍靛果花青素工藝優化

李圣橈，李若萌，陳博樸，張 衛，周亞軍

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林長春130062）

吉林省長白山地區藍靛果資源豐富、價格低廉，果實中含有大量的維C、氨基酸及黃酮類物質，提取物中花青素含量較高。其可被加工成藍靛果飲料、果醬等產品銷售，但因其味苦澀使其難以被接受，且加工中產生的皮渣被當作廢棄物扔掉，造成資源浪費。花青素（Anthocyanidin）是一種存在于植物中的水溶性色素，具有抗氧化活性、抗病毒和防治心血管疾病等功能[1]，可以幫助食品著色，對糖尿病等多種疾病的防治都有著顯著成效[2]。

長期以來，花青素的提取工藝較多采用傳統溶劑浸提法，但由于其存在提取時間長、提取率低、操作復雜等問題，難以滿足當今工業化需求。為尋求較為高效、快捷的提取方法，國內外學者進行了大量研究，并在超聲波[3]、微波[4]、高壓脈沖電場[5]等物理手段輔助提取法方面取得了一定的進展，但仍存在成本高、對提取物有破壞性等問題，因此未達到理想的提取效果。超高壓輔助提取技術（Ultra-high pressure-assisted extraction，UHP）是以水或其他流體為媒介，將處理樣品在100 MPa以上壓力下保持一段時間，使細胞壁結構被破壞、目標產物得以充分釋放的一種新型提取技術[6]。李鵬等人[7]利用超高壓輔助提取桑葚花色苷并對其抗氧化活性研究。楊孝輝等人[8]利用超高壓提取不同植物中的多糖。葉陳麗等人[9]利用超高壓技術提取金銀花中的綠原酸，但超高壓輔助提取藍靛果中花青素未見報道。采用超高壓輔助提取藍靛果中的花青素，并優化其工藝參數。以期為藍靛果深加工開辟新途徑，為花青素的高效提取提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果，吉林省延吉市二道白河鎮長白工坊生態產品有限公司提供。化學試劑：鹽酸、氯化鉀、冰醋酸，分析純；無水乙醇（食品級），均為北京化工廠提供。

1.2 儀器與試劑

BCD-180TMP型冷藏冷凍冰箱，海爾公司產品；PHSJ-4F型pH計，上海禹昂自動化科技公司產品；HPP600MPa/40L型超高壓食品處理裝置，包頭科發高壓科技有限責任公司產品；TU-1800型紫外分光光度計，上海元析儀器公司產品；PTF-A+200型電子天平，福州華志科學儀器有限公司產品；H2-16KR型高速冷凍離心機，湖南長沙可成儀器設備有限責任公司產品；YTLG-10A型真空冷凍干燥機，上海葉拓科技有限公司產品；HH-8型數顯恒溫水浴鍋，蘇州威爾儀器制造有限公司產品；THC-100型恒溫恒濕培養箱，上海容威儀器有限公司產品；XL-02A型手提式粉碎機，杭州旭眾機械設備有限公司產品。

1.3 超高壓輔助提取工藝流程

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）藍靛果粉末制備。將藍靛果通過凍干機干燥后粉碎成粉末、1 mm過篩，密封后置于干燥環境中貯藏備用。

（2）超高壓處理。取藍靛果粉末樣品于燒杯中，根據乙醇體積分數與料液比加入乙醇溶液，對其進行均質得到更均勻的樣品液。改變壓力和保壓時間等設備參數對樣品液進行處理[10]。

（3）離心。提取液放入高速冷凍離心機內，以轉速4 000 r/min離心12 min。

（4）測定吸光度。取上清液，分別用pH值4.5和1.0的緩沖溶液稀釋、搖勻，用蒸餾水作對照，于35℃下恒溫水浴30 min，于最大波長和700 nm處分別測其吸光度。

1.4 花青素含量檢測方法

花青素含量用pH值示差法檢測，通過紫外分光光度法計算求值，計算公式（1）。

式中：A-(A512-A700nm)pH1.0-(A512-A700nm)pH4.5；

Mw——分子量，449 g/mol；

V——提取液總容積，mL；

n——樣品稀釋倍數；

ε——消光系數，26 900 L·mol-·1cm-1；

b——光程數，1 cm；

m——原料的質量，g。

1.5 試驗設計

1.5.1 預試驗及傳統溶劑浸提工藝優化

對傳統溶劑提取法及超高壓提取法提取花青素進行預試驗，剔除無關變量，為進一步試驗做準備。通過研究乙醇體積分數、提取溫度、料液比和提取時間4個因素對傳統溶劑浸提法提取花青素含量的影響，并通過正交試驗得出最佳工藝參數。

1.5.2 超高壓輔助提取花青素單因素試驗

根據預試驗結果，選壓力、保壓時間、乙醇體積分數這3個因素進行超高壓輔助提取花青素單因素試驗，研究其對花青素提取量的影響。

超高壓提取花青素因素與水平設計見表1。

表1 超高壓提取花青素因素與水平設計

1.5.3 超高壓輔助提取花青素響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇對花青素提取量影響顯著的壓強（X）1、保壓時間（X）2、乙醇體積分數（X）33個因素進行三因素三水平的響應面試驗，優化出超高壓輔助提取花青素工藝的最佳參數。

響應面優化試驗變量與編碼見表2。

表2 響應面優化試驗變量與編碼

1.5.4 對比試驗

將超高壓輔助提取法與傳統溶劑浸提法最佳提取工藝參數與最大提取量進行對比分析，確定提取方法。

1.6 數據統計與分析

試驗結果為重復測定3次的平均值，用Origin 9.1和SPSS 20.0數據統計軟件對結果進行Anova和Duncan多重比較統計分析，用Design Expert 8.0.6進行響應面數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 最佳檢測波長的確定

取制備的含花青素提取液，置于紫外分光光度計中進行190～900 nm全波長掃描。

藍靛果花青素提取液光譜掃描曲線圖見圖1。

由圖1可知，掃描光譜曲線呈平滑拋物線狀，最大波峰為512 nm，故確定512 nm為花青素的最大吸收波長。

圖1 藍靛果花青素提取液光譜掃描曲線圖

2.2 壓強對花青素提取量的影響

在料液比1∶30，保壓時間3 min，乙醇體積分數40%的條件下，研究壓強對花青素提取量的影響。

壓強對花青素提取量的影響見圖2。

圖2 壓強對花青素提取量的影響

由圖2可知，壓強低于250 MPa時，增大壓強，花青素提取量顯著提高（p＜0.05）；壓強達到250 MPa，增大壓強，提取量顯著降低（p＜0.05）。譚佳琪等人[10]提取桑葚花色苷時也觀察到了相似趨勢。其原因可能是一定壓力值會使細胞器、細胞壁和細胞膜受損，細胞滲透能力增加，有利于提取溶劑進入細胞，促進藍靛果中有效成分滲透到細胞外，提高花青素的提取率[11]。因此，最佳作用壓強選250 MPa。

2.3 保壓時間對花青素提取量的影響

在壓強250 MPa，料液比1∶30，乙醇體積分數40%的條件下，研究保壓時間對花青素提取量的影響。

保壓時間對花青素提取量的影響見圖3。

圖3 保壓時間對花青素提取量的影響

由圖3可知，在保壓時間小于3 min時，花青素提取量隨保壓時間的增加而顯著增加（p＜0.05），當保壓時間達到3 min后，增大保壓時間花青素提取量顯著降低（p＜0.05）。與杜月嬌等人[12]在提取山葡萄花青素試驗結果趨勢一致。因為藍靛果細胞隨著保壓時間延長而破裂，目標成分被提取出來，但時間過長會促進酶促反應進行，導致花青素降解，使提取率降低。因此，最佳保壓時間選3 min。

2.4 乙醇體積分數對花青素提取量的影響

在壓強250 MPa，料液比1∶30，保壓時間3 min的條件下，研究乙醇體積分數對花青素提取量的影響。

乙醇體積分數對花青素提取量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數對花青素提取量的影響

由圖4可知，當乙醇體積分數為20%～40%時，花青素提取量顯著增大（p＜0.05），并于乙醇體積分數為40%時達到最大，乙醇體積分數達到40%后，繼續增大乙醇體積分數，花青素提取量顯著降低（p＜0.05）。王鑫等人[13]利用超高壓提取藍莓花青素得到了類似的結果。原因可能是花青素屬于黃酮類物質，在乙醇中的溶解性較好，隨著其體積分數增大，花青素溶出率增加；當乙醇體積分數過大后，使溶液極性降低，花青素溶解性隨之降低且易發生醇降現象，不利于花青素的提取。因此，乙醇最佳體積分數選為40%。

2.5 響應面設計及結果

花青素提取量Y與壓強（X）1、保壓時間（X）2和乙醇體積分數（X）33個因素的響應面試驗設計及結果。

響應面優化試驗設計及結果見表3。

2.6 回歸模型建立及方差分析

對表3的數據進行回歸分析，得響應變量與響應值間的二次回歸方程：

表3 響應面優化試驗設計及結果

二次回歸模型的方差分析見表4。

由表4可知，數學模型F=36.79，p＜0.000 1，說明回歸模型極為顯著；失擬項F=0.755 2＞0.05，說明方程擬合良好；決定系數R2=0.979 4，調整系數R2Adj=0.952 6，說明響應值與自變量間線性關系顯著，模型可信度較高。該模型可用于解釋花青素提取量的變化。

表4 二次回歸模型的方差分析

2.7 響應面分析

通過軟件Design Expert 8.0.6分析得壓強與保壓時間、壓強與乙醇體積分數、保壓時間與乙醇體積分數的交互作用。

保壓時間與壓強交互作用及等高線圖見圖6，乙醇體積分數與壓強交互作用及等高線圖見圖7，乙醇體積分數與保壓時間交互作用及等高線圖見圖8。

由圖6可知，響應曲面較陡，表明花青素提取量受二因素影響顯著；二者軸向等高線分布均勻，呈橢圓狀，交互作用較強。由圖7可知，響應曲面較陡，花青素提取量受兩因素影響顯著；等高線呈橢圓狀，二者交互作用較強。由圖8可知，響應曲面較陡，花青素提取量受二因素影響較大；二者軸向等高線呈橢圓狀并均勻分布，二者交互作用顯著。但是，由方差分析可知，壓強和保壓時間、壓強和乙醇體積分數、保壓時間和乙醇體積分數交互作用均對花青素含量的影響并不顯著。

圖6 保壓時間與壓強交互作用及等高線圖

圖7 乙醇體積分數與壓強交互作用及等高線圖

圖8 乙醇體積分數與保壓時間交互作用及等高線圖

2.8 響應面試驗優化結果及驗證

超高壓提取藍靛果花青素最佳工藝為壓強260.5 MPa，保壓時間3.5 min，乙醇體積分數33.1%，此時花青素提取量理論最大值為36.31 mg/g。考慮實際操作，對工藝適當調整，調整后工藝為壓強250 MPa，保壓時間3.5 min，乙醇體積分數33%，該參數重復3次取平均值，得花青素提取量為36.15 mg/g，與預測值接近。模型能用于預測花青素提取量。

2.9 對比試驗分析

將超高壓輔助提取法和傳統溶劑浸提法最優工藝參數與最大提取量進行對比。

超高壓提取與傳統溶劑提取花青素的對比見表5。

表5 超高壓提取與傳統溶劑提取花青素的對比

由表5可知，相較于傳統溶劑浸提法，超高壓輔助提取耗時少、操作簡便，且花青素提取量提高了44.3%。綜合考慮實際操作、提取效果和成本，超高壓電場輔助提取法能高效提取藍靛果花青素。

3 結論

單因素試驗和響應面法優化試驗確定藍靛果花青素超高壓提取工藝最佳參數為壓強260.5 MPa，保壓時間3.5 min，乙醇體積分數33.1%，花青素最大提取量為36.31 mg/g。與傳統溶劑浸提法相比，超高壓輔助提取顯著節省提取時間，節約了乙醇用量，花青素提取量提高了44.3%，是一種比較理想的天然產物提取方法。研究為超高壓技術在生物質中有效成分的高效提取提供理論支持和借鑒參考。