基于響應面優化大麥若葉粉中總黃酮超聲波提取工藝研究

盧健新，袁學文，蔡文韜，馮麗娜

（廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州510303）

0 引言

大麥是禾本科一年生草本植物，其幼苗富含多種營養物質，如維生素、類黃酮、抗氧化酶、蛋白質、葉綠素等[1]。大麥苗在其生長期可以吸收外源性的營養成分，如氨基葡萄糖、羥脯氨酸等[2]。國外的研究表明，大麥不僅是中東、非洲北部、亞洲和歐洲等地區主要的糧食作物，也是利用最頻繁及抗性最強的禾谷類作物，在預防和醫治人類部分慢性疾病方面有顯著效果。大麥的這些功能一開始并未得到人們的關注，直到近50年，隨著現代科技的更新發展，大麥若葉才逐步進入廣大研究者及消費者的視線。

生物總黃酮也叫黃酮類化合物，是許多中草藥的有效成分，而黃酮類化合物是大麥若葉的活性成分之一。提取植物體內總黃酮的方法較多，考慮到學校的實驗室情況，以及超聲波法操作較簡單、提取物質結構不易被破壞的特點，試驗采用超聲波來協助提取大麥若葉粉中的總黃酮。

相關研究發現，大麥若葉的功效主要集中在5個方面：①清理體內毒素，降低血液中的甘油三脂和膽固醇含量；②減緩肥胖癥狀；③抗氧化、抗抑郁[3-4]；④舒緩疲勞、強健體質、改善睡眠、提高免疫力并加快傷口愈合；⑤養護胃腸道功能，減弱酒精對胃黏膜的損傷[5-6]。大麥苗提取物的氣味還能激活人體自主神經，從而影響副交感神經的活動[7]。大麥苗具備這些保健功效極有可能與其含有較多的抗氧 化 酶 類[8]、葉 綠 素[9]、γ-氨 基 丁 酸[10-13]、黃 酮 類O-葡萄糖異牡荊苷等物質有關[14-15]。

早在公元前4世紀，西方一個名為Hippocrates的醫學家也曾經用大麥若葉汁來醫治人們血液或肝臟疾病[16]。目前，大麥葉制品已經被日本衛生協會認定為健康食品。美國也正式批準了將麥綠素作為食品補充劑。而在我國，1994年生物化學博士徐新月從美國首次將麥綠素概念引入中國，自此我國開始真正對大麥苗產品展開研究。隨著“大麥若葉熱”的傳播，我國不少企業通過不同加工方式制得多種大麥苗產品[17]。21世紀以來，國內越來越多研究者開始對大麥苗粉展開研究，研究人員陸續發現黃酮類化合物具有預防肝損傷、抗氧化、降血脂、降血糖及提高機體免疫力等多項生理功能。楊立紅等人[18]在對小鼠進行試驗后，得出大麥苗具有抗疲勞、增強耐力的結論。黃薇等人[19]發現用大麥若葉進行膳食指導能緩解痛風患者的疼痛和焦慮感。

研究旨在通過超聲波提取法對市面上的一種大麥若葉粉的總黃酮進行提取和測定，并通過設計響應面試驗來優化該種大麥若葉粉總黃酮的提取工藝條件，從而得到最佳提取工藝參數，可以進一步加深人們對近年來“大麥若葉熱”的認識，同時對更深入地了解其功能有著重大作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用的大麥若葉粉是把新鮮的大麥若葉苗用水清洗、干燥、氣流粉碎后制成的純粉末，由浙江省紹興市上虞萬事達麥業有限公司生產。

蘆丁標準品，中國食品藥品檢定研究所提供；75%乙醇；95%乙醇；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

臺式超聲波清洗器、科盟牌超聲波清洗機；紫外-可見分光光度計，上海精科實業有限公司產品；低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品；電子天平，常州市衡正電子儀器有限公司產品；10 mL，25 mL容量瓶，錐形瓶、試管、玻璃棒、膠頭滴管、洗耳球、離心管、燒杯；稱量紙、10 mL，2 mL，1 mL移液管等。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線繪制

蘆丁標準溶液制備及吸光值測定的具體操作參考文獻[20]。

1.3.2 大麥若葉粉總黃酮提取率的測定公式

蘆丁標準曲線回歸方程為A=12.879C-0.141 3（R2=0.999），其中C為供試品總黃酮質量濃度（mg/mL），A為吸光值。將吸光值代入標準曲線可得總黃酮的質量濃度C，黃酮提取率計算公式見下式：

式中：Y——樣品中總黃酮提取量，mg/g；

M——樣品質量，g；

C——供試品總黃酮質量濃度，mg/mL。

1.3.3 超聲波輔助提取大麥若葉粉黃酮類化合物的工藝流程

（1）樣品提取液的制備。取1 g大麥若葉粉末，加入10 mL 75%乙醇浸泡2 h后，在45℃、40 kHz下超聲處理40 min，冷卻至室溫，調節離心機以轉速1 000 r/min離心10 min，取上清液，用體積分數75%的乙醇定容至15 mL。

（2）供試品溶液的制備。精確吸取步驟（1）中制備的樣品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中加入適量體積分數75%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻即得到供試品溶液。

（3）供試品含量測定。精確吸取步驟（2）中制備的供試品溶液5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，測得吸光度值，記錄數據。

1.3.4 超聲波輔助提取大麥若葉粉總黃酮單因素試驗

考查提取溫度（35，45，55，65，75℃）、提取時間（30，40，50，60，70 min）、乙醇浸泡時間（30，60，90，120，150 min）、乙 醇 體 積 分 數（55%，65%，75%，85%，95%）、料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）對大麥若葉粉總黃酮提取量的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

依據單因素試驗結果，綜合考慮現實條件及資源節約原則，選取超聲波提取溫度、超聲波提取時間、乙醇浸泡時間為自變量，以總黃酮提取量為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，利用Design Expert 10.0軟件進行數據分析。

響應面設計試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面設計試驗因素與水平設計

1.3.6 試驗分析

采用Excel軟件、Design Expert10.0軟件進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

根據測定結果，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，利用Excel軟件繪制出的蘆丁標準線。

蘆丁標準曲線圖見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線圖

由圖1可得回歸直線方程Y=12.879X-0.141 3，其中R2=0.999，吸光值線性范圍0.291A～0.727A，標準曲線質量濃度范圍內線性良好。

2.2 大麥若葉粉總黃酮的提取單因素試驗

2.2.1 提取溫度對大麥若葉總黃酮提取量的影響

提取溫度對大麥若葉總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 提取溫度對大麥若葉總黃酮提取量的影響

由圖2可知，超聲波提取溫度在35℃時大麥若葉粉總黃酮提取量最小，為3.77 mg/g；提取溫度為35～65℃，提取量逐漸上升；當提取溫度達到65℃后，總黃酮提取量則降低。

這表明在一定范圍內，增大超聲波提取溫度能夠提高大麥若葉總黃酮提取量，因為將乙醇作為提取溶劑時，超聲波溫度的升高會加快了黃酮分子的熱運動，增大可溶性溶質分子的溶解度及擴散系數，擴散速度加快使越來越多的黃酮分子溶解在乙醇中；但當溫度超過65℃后，過高的溫度破壞了部分不耐熱黃酮類化合物的結構，使浸提液的品質發生劣變，導致總黃酮提取量降低。考慮總黃酮提取量和能源損耗等因素，選取提取溫度為55，65，75℃的3個水平進行響應面試驗。

2.2.2 提取時間對大麥若葉總黃酮提取量的影響

提取時間對大麥若葉總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 提取時間對大麥若葉總黃酮提取量的影響

由圖3可知，當超聲提取時間為30 min時，大麥若葉粉總黃酮提取量最低，之后大麥若葉粉總黃酮提取量與提取時間呈正比；當提取時間為40 min時，大麥若葉粉總黃酮提取量達到頂峰，此后大麥若葉粉總黃酮提取量與提取時間呈反比。

表明在一定范圍內，提取時間的延長會使黃酮類化合物分子進行熱運動的時間增加，導致更多的分子溶解到乙醇溶劑中，從而使提取量增加；當提取時間超過40 min時，由于超聲波比較強的的剪切效應會促使部分黃酮類化合物損失，導致總黃酮的提取量的降低。因此，考慮總黃酮提取量和能源損耗等因素，選取超聲波提取時間35，40，45 min作為響應面試驗研究水平。

2.2.3 浸泡時間對大麥若葉總黃酮提取量的影響

乙醇浸泡時間對大麥若葉總黃酮提取量的影響見圖4。

由圖4可知，當乙醇浸泡時間為30 min時，大麥若葉粉總黃酮提取量最小，隨著乙醇浸泡時間的延長，大麥若葉粉總黃酮提取量逐漸增大；當乙醇浸泡時間達到90 min時，繼續延長浸泡時間，總黃酮提取量轉而下降。

表明在一定條件下，增加乙醇浸泡時間，能夠提高總黃酮的浸取量，即浸出量與浸取時間呈正比；當浸取時間延長到90 min時，大麥若葉粉總黃酮浸取量達到最大值，此后隨著時間的延長，總黃酮提取量不升反降，出現此種現象的原因較為復雜，可能是固體形態的黃酮類化合物在向溶液擴散的時候，有一部分浸出的不太穩定的黃酮類化合物因時間過長已經氧化分解，因而使總黃酮提取量下降[20]；此外，長時間的浸提通常會導致大量雜質的浸出，而一些有效成分如苷類易被同時存在的酶所水解[21]；根據圖4所示可得出當乙醇提取時間為90 min時，大麥若葉粉總黃酮提取量達到最大值。因此，選擇超聲波提取時間為60，90，120 min的3個水平作為響應面試驗研究水平。

圖4 乙醇浸泡時間對大麥若葉總黃酮提取量的影響

2.2.4 乙醇體積分數對大麥若葉總黃酮提取量的影響

乙醇體積分數對大麥若葉總黃酮提取量的影響見圖5。

圖5 乙醇體積分數對大麥若葉總黃酮提取量的影響

由圖5可知，乙醇體積分數為55%～85%，大麥若葉總黃酮提取量是呈現上升趨勢，當乙醇體積分數超過85%后，大麥若葉總黃酮提取量增加趨勢不明顯（p=0.852＞0.05），基本趨于平穩。

表明在一定范圍內，總黃酮提取量與乙醇體積分數呈正比，這是因為不同體積分數的乙醇溶液具有不同的極性，根據相似相溶的原理，乙醇溶液的極性與大麥若葉含有的總黃酮極性越接近，黃酮分子越容易溶解在溶劑中，總黃酮提取量便越大；但當乙醇體積分數超過85%，溶劑極性的偏低則會導致溶液中一些弱極性物質的溶出，從而影響到黃酮分子的提取。

2.2.5 料液比對大麥若葉總黃酮提取量的影響

料液比對大麥若葉總黃酮提取量的影響見圖6。

圖6 料液比對大麥若葉總黃酮提取量的影響

由圖6可知，料液比從1∶10到1∶30，大麥若葉總黃酮提取量呈現不斷上升趨勢，表明料液比與大麥若葉粉總黃酮提取量呈反比，這是由于較高的料液比會阻礙黃酮分子的溶出，而乙醇溶液用量的增多則使黃酮質量濃度降低，增大了溶劑與黃酮分子的接觸面積，使更多的黃酮分子能夠充分溶解在乙醇溶液中，提高了總黃酮的提取量。

2.2.6 單因素試驗方差分析

利用SPSS Statistics軟件，對不同提取溫度、提取時間、浸泡時間、乙醇體積分數、料液比下得到的大麥若葉總黃酮提取量進行方差分析。

5個單因素試驗方差分析結果見表2。

由表2可知，5個影響因素的p值表明提取溫度、提取時間、浸泡時間、乙醇體積分數、料液比對大麥若葉總黃酮的提取量均具有極顯著的影響。

2.3 響應面優化大麥若葉總黃酮提取工藝的研究

根據單因素試驗的結果，綜合考慮實驗室條件及節能回收，選取提取溫度（55，65，75℃）、提取時間（30，40，50 min）、乙醇浸泡時間（60，90，120 min）3個因素3個水平進行響應面優化試驗。應用響應面軟件進行分析，考查提取溫度、提取時間、浸泡時間的最佳提取工藝參數。

2.3.1 模型方程的建立與顯著性檢驗

采用響應面法對大麥若葉總黃酮提取工藝進行優化，以超聲波提取溫度（A）、超聲波提取時間（B）、乙醇浸泡時間（C）為自變量，大麥若葉粉總黃酮提取量（Y）為響應值。

響應面試驗方案及結果見表3。

采用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行擬合和擬合系數的顯著性分析。

回歸模型方差分析見表4。

表4 回歸模型方差分析

利用響應面軟件中的Box-behnken選項對表3數據進行多元回歸擬合，可得到大麥若葉粉總黃酮提取量Y對自變量提取溫度（A）、提取時間（B）和浸泡時間（C）的二次多項回歸方程：

表3 響應面試驗方案及結果

由表4可知，對該模型進行F檢驗，模型p值為0.017 3，小于0.05，說明該模型具有顯著性。此外，模型的失擬性檢驗是不顯著的（Prob.＞F＞0.05），說明預測值和實際測量值之間具有相關性，所建立的回歸模型擬合度良好，模型方程能反映真實的試驗值，可用該模型分析和預測超聲波法提取大麥若葉粉總黃酮提取量。

用F值判定回歸方程中各因素對大麥若葉粉總黃酮提取率的影響，各因素對大麥若葉粉總黃酮提取量影響的大小順序為A＞C＞B，表明超聲波提取溫度對大麥若葉粉總黃酮提取量的主效應明顯；其中，B2影響極顯著，A和AC影響顯著，A、C、AB、BC、A2、C2影響不顯著。回歸方程相關系數R2為0.876 5，說明該模型滿足了87.65%的樣本空間。

2.3.2 響應曲交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6軟件得到相應的二次回歸方程的響應面3D立體圖和等高線圖。根據模型所做的響應曲面及其等高線圖可比較形象直觀地展現出2個試驗因素之間的相互關系，以及確定每個自變量的最優水平范圍[22]。

提取溫度與提取時間交互作用對大麥若葉粉總黃酮提取量影響的響應面（a）及等高線（b）見圖7，浸泡時間與提取溫度交互作用對對大麥若葉粉總黃酮提取量影響的響應面（a）及等高線（b）見圖8，浸泡時間與提取時間交互作用對大麥若葉粉總黃酮提取量影響的響應面（a）及等高線（b）見圖9。

圖7 提取溫度與提取時間交互作用對大麥若葉粉總黃酮提取量影響的響應面（a）及等高線（b）

由圖7可知，3D圖曲面變化陡峭，表明交互作用項提取溫度與提取時間之間具有交互作用，等高線圖呈現橢圓形，說明提取溫度與提取時間之間交互作用顯著。

由圖8可知，3D圖曲面變化陡峭，表明交互作用項提取溫度與浸泡時間之間具有交互作用，等高線圖呈現橢圓形，說明提取溫度與浸泡時間之間交互作用顯著。

由圖9可知，3D圖曲面變化陡峭，表明交互作用項提取時間與浸泡時間之間具有交互作用，等高線圖呈現橢圓形，說明超聲波提取時間與乙醇浸泡時間之間的交互效應較顯著。

由圖7～圖9可知，3組交互作用項提取溫度與提取時間、提取溫度和浸泡時間、提取時間與浸泡時間的交互作用均顯著；但是提取溫度和浸泡時間的交互作用比提取溫度和提取時間、提取時間與浸泡時間的交互作用顯著，這點可從圖8的響應面圖顏色變化最為劇烈，且3D圖坡度最陡得以驗證。該結果與表8方差分析中回歸模型顯著性檢驗結果一致，從圖7～圖9響應面的3D圖坡度和等高線形狀可見，在所選的范圍內存在極值[23-24]。

圖8 浸泡時間與提取溫度交互作用對對大麥若葉粉總黃酮提取量影響的響應面（a）及等高線（b）

圖9 浸泡時間與提取時間交互作用對大麥若葉粉總黃酮提取量影響的響應面（a）及等高線（b）

2.4 響應面優化大麥若葉總黃酮提取工藝的研究

2.4.1 殘差分析結果

殘差在統計學中特指理論值與實際測量值之間的差值。對模型進行殘差分析可以判斷響應面優化模型的準確性。假如建立的回歸模型準確度較高，則表明可以將殘差看作誤差的觀測值。

殘差正態分布圖見圖10，預測值與殘差見圖11。

圖10 殘差正態分布圖

圖11 預測值與殘差

由圖10可知，該模型殘差擬合曲面圖中各散點分布符合線性態勢且呈正態概率分布；由圖11可知，經過響應面試驗優化之后，預測值的內部優化殘差呈現散點式的隨機分布，說明殘差的方差齊性符合要求。因此，試驗擬合的數值模型是可行的[25]。

2.4.2 預測值與實測值擬合結果

預測值與實測值見圖12。

圖12 預測值與實測值

由圖12可知，數據呈現散點分布且沿模型診斷呈現近似一條直線，表明模型預測值和實測值擬合良好，說明該試驗誤差不大。

2.5 工藝模型的優化和回歸曲線的檢驗

經Design Expert 8.0.6軟件分析，可得到超聲波輔助提取大麥若葉粉總黃酮的最佳工藝條件為超聲波提取溫度75℃，超聲波提取時間44.50 min，乙醇浸泡時間60.00 min，提取量4.404 98 mg/g。考慮到試驗的可操作性，將優化條件修正為超聲波提取溫度75℃，超聲波提取時間45 min，乙醇浸泡時間60 min。

基于響應面優化得到的最佳條件對大麥若葉粉進行3次超聲波輔助提取的平行試驗，得到大麥若葉粉總黃酮提取量分別為4.45，4.34，4.38 mg/g，求得平均值為4.39 mg/g，驗證試驗平均值與預測得到的總黃酮提取量4.40 mg/g僅相差0.01 mg/g。因此，試驗模型具有準確性，表明采用響應面法優化得到的總黃酮提取條件準確、可靠，具有參考價值，即優選的工藝條件穩定可行。

3 結論

通過運用超聲波提取法對市面上的一種大麥粉進行總黃酮的提取和測定，利用Design Expert 8.0.6軟件對總黃酮提取率的二次回歸模型進行設計分析，結果表明模型擬合度較高，試驗誤差較小。運用響應面法優化大麥若葉粉總黃酮的超聲波輔助提取工藝，可得到最佳工藝條件為超聲波提取溫度75℃，超聲波提取時間45 min，乙醇浸泡時間60 min，在最佳條件下，總黃酮提取量為4.39 mg/g，與理論值4.40 mg/g的相對誤差為0.01 mg/g。方差分析結果顯示，影響大麥若葉粉總黃酮提取量大小因素依次為提取溫度＞浸泡時間＞提取時間[26]。

試驗使用響應面法進行工藝優化設計，主要是由于響應面試驗設計克服了正交試驗設計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區域上因素的最佳組合和響應值最優值的缺陷。此外，響應面設計還能減少試驗次數，分析幾種因素間的交互作用，從而達到較全面地反映各因素水平的的效果。因此，響應面法可以更好地對大麥若葉粉總黃酮的提取工藝進行回歸分析和參數優化。