應用TLC-CMS技術檢測核桃青皮中吲哚類生物堿

楊衛民，杜京旗，路文靜

（呂梁學院，呂梁林果植物化學省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西呂梁033001）

核桃（Juglans regia L）.又稱胡桃，羌桃，為胡桃科植物。核桃青皮、花、葉中均含有一定量的不同種類的生物堿成分。作為一類來源于生物界的含氮有機物質，大部分生物堿分子的結構特性一般較為復雜，多具有顯著的生理藥理效應，呈現不同程度的堿性，是中草藥的重要有效成分。一些生物堿由于在生物制藥和衛生等方面具有很強的實用性潛能和開發市場，正逐漸成為人們研究熱點，具有抗腫瘤、抗病毒、消炎等醫學方面的作用。

吳茱萸堿結構式見圖1。

圖1 吳茱萸堿結構式

吲哚類生物堿是具有吲哚分子骨架的一類化合物，具有多種良好的生理活性。目前，吲哚類生物堿的研究成為抗腫瘤藥物研發的熱點之一，特別是在新藥及其新藥先導化合物發現中具有不可替代的作用[1-3]。吲哚類生物堿抗腫瘤機制一般可分為2類，一類是直接殺傷腫瘤細胞，另一類是干擾細胞周期的有絲分裂階段，抑制腫瘤細胞的分裂和增殖。此外，吲哚類生物堿抗腫瘤成分在誘導腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞凋亡和提高機體免疫力方面也表現出一定的作用。核桃青皮等是一種具有前景的抗腫瘤新藥[4]。

核桃青皮、花、葉內均富含多種生物活性物質，關于青皮中有效化學成分的提取已被報道[4]。然而，目前生物堿的獲取途徑仍然比較單一，生物堿中的許多種類還沒有得到深層次的研發。從當前的研究發展來看，局限性主要表現為某些分離技術的不成熟，比如較高的純化成本、較低的分離產量等問題，尤其是大部分分離純化技術尚處在實驗室研究階段。試驗以核桃不同部位為原料，75%的甲醇為提取劑，經微波超聲波組合萃取儀輔助處理，用薄層層析分離純化獲得三萜類化合物，用TLC-CMS技術對其進行了檢測與表征，該技術可直接從TLC薄層板上獲取質譜圖，其優點是不經過樣品前處理，可快速從復雜混合物中獲得目標物分子質量信息，并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及主要儀器

材料：核桃青皮、葉、枝條，均采集于呂梁。

試劑：甲醇、石油醚、氯仿、苯、冰乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、環己烷等，均為分析純；色譜甲醇；薄層硅膠板色譜分析板；吳茱萸堿（CAS：518-17-2；純度＞99%），購買于中檢所。

儀器：ALB-224型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；XH-300B型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發展有限公司產品；KH-3000Plus型薄層色譜儀，上海科哲生化科技有限公司產品；Expressions型質譜儀、Plate ExpressTLC-質譜接口，美國Advion公司產品；Tensor-11型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司產品。

1.2 試驗方法與步驟

1.2.1 總生物堿的粗提取

核桃青皮陰干、粉碎、過80目篩，稱取7.2 g核桃青皮粉，以料液比1∶30加75%甲醇溶液，恒溫振蕩24 h，溫度45℃。

超聲波微波組合萃取儀分3個階段提取，每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，分別設置溫度為40，45，50℃；超聲波功率為850，900，800 W；微波功率為100，200，300 W；超聲波頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉速900 r/min。

提取液以轉速4 000 r/min離心10 min，3次，合并上清液，上清液用0.45 μm微膜減壓過濾，于水浴溫度為65℃下濃縮至體積的1/4。

等量石油醚除雜3次，用鹽酸酸化至pH值2～3時，等量氯仿萃取3次。用氫氧化鈉堿化至pH值9～10時，用等量的氯仿∶甲醇溶液（3∶1，V/V）混合液體萃取3次，獲取氯仿甲醇相后。濃縮至固體狀，用色譜甲醇定容至10 mL。

核桃葉和枝處理方法與上述相同。

1.2.2 樣液中吳茱萸堿含量檢測

配制0.010 000，0.005 000，0.002 500，0.001 250，0.000 625 mg/mL質量濃度梯度的吳茱萸堿甲醇溶液，在最大吸收峰下測定其吸光度，繪制標準曲線。

分別檢測新鮮核桃青皮和葉、陳葉、枝提取液的吸光度，計算其含量。

1.2.3 薄層色譜分離純化

用微量進樣器吸取25 μL吲哚類生物堿對照品溶液，置于全自動點樣機上，設置點樣參數（點樣間距10 mm，點樣寬度8 mm，點樣數目4，點樣量分別為2，4，6，點樣速度5 s/μL），在聚酰胺薄膜上進行點樣；再吸取25 μL供試品溶液，點樣20 μL。

配制甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚展開劑，倒入展開缸后蓋等待20 min，將點樣完成的硅膠板輕輕放入展開劑液面高2～3 mm的平臥式展開缸內，待到展開劑前沿距離硅膠板頂端約1 cm處時，取出晾干。將晾干的層析板放入薄層色譜成像系統，在365 nm的紫外光燈下觀察層析情況，并拍照記錄[5-6]。

1.2.4 紅外光譜儀檢測

將儀器和軟件打開使其處于工作狀態，在測量每一個樣品之前，都需要測量單通道背景光譜，然后將樣品用毛細管點樣至光學臺的金剛石上，再進行單通道樣品光譜的測量。每一個樣品測量后，都需要進行譜圖處理，如進行氣氛補償，可消除CO2、H2O的干擾。然后將檢測出來的光譜轉換成倒峰，選擇單峰檢索標出每一個特征峰，保存并進行分析[7-9]。

1.2.5 質譜儀檢測

標準品的質譜檢測：用色譜甲醇和超純水作為流動相。將儀器和軟件打開使其處于工作狀態，用微量進樣器吸取10 μL的吳茱萸堿標準品溶液插入到進樣口處，打到load檔開始進樣，進完樣后打回到inject檔。點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

待測液的質譜檢測：流動相與測標準品的流動相相同。使儀器和軟件處于工作狀態，將待測品薄層板置于TLC-質譜接口上，使激光對準圈出的吳茱萸堿斑點中心處[10]。用軟件操作進行取樣，點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

1.2.6 樣液比旋光度和熔點檢測

通過對TLC的圖譜色譜的分析，判定所分離的物質是有效分離，將分離物放入旋光儀中先用甲醇進行校正，然后將溶液倒入，調節模式，測定其旋光度和比旋光度，記錄數值及其平均值。

將提取的樣液放入蒸發皿中，在電熱板上蒸發結晶成為固體，然后將固體放入一端封口的毛細管中，插入熔點儀中，調節適當的電壓來升溫，當固體變為固液平衡的狀態時，溫度計上顯示的溫度即為該物質的熔點[11-12]。

2 結果與分析

2.1 吲哚類生物堿的粗提取

吳茱萸堿標準品紫外光譜圖見圖2，吳茱萸堿的標準曲線見圖3。

圖2 吳茱萸堿標準品紫外光譜圖

圖3 吳茱萸堿的標準曲線

由圖2可以看出，吳茱萸堿標準品于波長200～700 nm時進行光譜波峰掃描，于波長224 nm處有最大吸收波峰。

由圖3可以看出，吳茱萸堿在最大吸收波峰下的標準曲線為：

Y=154.72X+0.005 5，相關系數為0.992 5，線性關系良好。

核桃供試樣品中總生物堿的提取率和吳茱萸堿含量見表1。

表1 核桃供試樣品中總生物堿的提取率和吳茱萸堿含量

由表1可以看出，無論總生物堿的提取率還是吳茱萸堿的含量，核桃青皮中為最高，新鮮葉其次，枝條和陳葉中為最低[13]。

2.2 薄層色譜分離與分析

核桃青皮樣液TLC成像圖見圖4，核桃新鮮葉樣液TLC成像圖見圖5，核桃陳葉樣液TLC成像圖見圖6，核桃嫩枝樣液TLC成像圖見圖7。

圖4 核桃青皮樣液TLC成像圖

圖5 核桃新鮮葉樣液TLC成像圖

圖6 核桃陳葉樣液TLC成像圖

圖7 核桃嫩枝樣液TLC成像圖

由圖4～圖7可以看出，在不同配比的展開劑下，核桃青皮和新鮮葉樣液色譜斑點較多，展開效果良好，色譜斑點清晰。核桃陳葉和枝條樣液色譜斑點較少，展開效果一般，陳葉樣液色譜斑點有拖尾現象[14-16]。

該檢測結果與紫外分析結果一致。

核桃青皮樣液與吳茱萸堿標準品TLC成像圖見圖8，新鮮核桃葉與吳茱萸堿標準品TLC成像圖見圖9。

圖8 核桃青皮樣液與吳茱萸堿標準品TLC成像圖

圖9 新鮮核桃葉與吳茱萸堿標準品TLC成像圖

核桃青皮等4種原料提取液所選用的4種展開劑是經過優化試驗條件確定的。由于核桃各部分所含化學成分不同，選取的原料在儲存上也有較大差異，因此選擇了不同的展開劑。

經過對核桃青皮等提取液的光譜掃描，以及與吳茱萸堿光譜波峰比對，可初步確定提取的樣品中含有吲哚類生物堿。但是，核桃青皮等提取液到底含有哪一種生物堿，需要對其與標準品進行比對，若有大致相同Rf值的物質出現，即可進一步確定所提取的物質是吲哚類生物堿[17]。

由圖8可以看出，用甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚（2∶16∶2∶5，V/V）作為展開劑，核桃青皮樣品與吳茱萸堿標準品在同一硅膠板上展開，晾干后在紫外光下觀察拍攝。結果顯示，核桃青皮樣品展開后色譜斑點很多，標記斑點A、B和C，其中斑點A吳茱萸堿標準品的Rf值基本一致，且非常清晰。可初步確定所提取的樣品中含有吳茱萸堿，以及與吳茱萸堿極性相近的其他生物堿類化合物[18-19]。

由圖9可以看出，在展開劑為甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚（1∶9∶2∶5，V/V）下，出現較為明顯的色譜斑點3個，其中斑點A與吳茱萸堿標準品展開位置基本相同，Rf值也大致相同。斑點B和C與吳茱萸堿標準品位置鄰近，可能是極性相近的生物堿。

2.3 質譜檢測結果與分析

吳茱萸堿標準品質譜圖見圖10，色譜斑點A質譜圖見圖11。

圖10 吳茱萸堿標準品質譜圖

圖11 色譜斑點A質譜圖

通過查閱相關文獻[20]可以得知，分子離子峰的識別首先是該離子峰范圍內最大的峰值（m/z），其次需要判斷該物質是否符合氮規劃，不含N或含偶數N的有機分子，其分子離子峰的m/z（即分子量）為偶數。含奇數N的有機分子，其分子離子峰的m/z（即分子量）為奇數，這兩點是識別離子峰的關鍵。

吳茱萸堿分子式為C19H17N3O，分子量為303，含3個氮原子，其分子離子峰m/z 303左右，為奇數。

由圖11可以看出，色譜斑點A的分子離子峰為m/z 305.3，其分子離子峰滿足氮規則。分子離子峰與較小的碎片離子峰產生了合理的碎片丟失（Δm），Δm=305.3-304.4≈1，表示在電子轟擊下打掉了1個H，因此為合理丟失。

色譜斑點B質譜圖見圖12。

圖12 色譜斑點B質譜圖

由圖12可以看出，色譜斑點B的質荷比（m/z）在360以上，而吳茱萸堿的相對分子質量為303，色譜斑點B不是吳茱萸堿，可能為其他吲哚類化合物。

色譜斑點C質譜圖見圖13。

圖13 色譜斑點C質譜圖

由圖13可以看出，色譜斑點C與吳茱萸堿標準品質譜圖有相近的分子離子峰（304.2，332.1，333.2），故推測斑點C與吳茱萸堿可能有相似的分子組成，具體結構有待進一步分析。

2.4 紅外檢測結果與分析

吳茱萸堿標準品的紅外光譜圖（甲醇，第一次）見圖14，吳茱萸堿標準品的紅外光譜圖（甲醇，第二次）見圖15。

圖14 吳茱萸堿標準品的紅外光譜圖（甲醇，第一次）

圖15 吳茱萸堿標準品的紅外光譜圖（甲醇，第二次）

由圖14和圖15可以看出，吳茱萸堿標準品（甲醇）2次紅外檢測的結果大致一致，但存在差異（1 650 cm-1和1 669 cm-1，1 449 cm-1和1 448 cm-1，1 411 cm-1和1 392 cm-1，1 113 cm-1和1 112 cm-1，1 019 cm-1和1 017 cm-）1，可視為試驗誤差。

吳茱萸堿標準品的紅外光譜圖（氯仿）見圖16。

圖16 吳茱萸堿標準品的紅外光譜圖（氯仿）

由圖16可以看出，吳茱萸堿標準品（氯仿）和甲醇溶的吳茱萸堿，兩者共同的峰值為吳茱萸堿的特征峰。（2 945 cm-1和2 918 cm-1，2 833 cm-1和2 850 cm-1，1 650 cm-1和1 638 cm-1，1 449 cm-1和1 479 cm-1，1 411 cm-1和1 424 cm-1，1 281 cm-1和1 269 cm-）1。

色譜斑點A的紅外光譜圖（甲醇）見圖17，色譜斑點B的紅外光譜圖（甲醇）見圖18。

圖17 色譜斑點A的紅外光譜圖（甲醇）

圖18 色譜斑點B的紅外光譜圖（甲醇）

由圖17可以看出，色譜斑點A在3 280 cm-1處出現了N-H的伸縮振動吸收峰，在1 654 cm-1處出現了C=O的特征吸收峰，在2 944 cm-1和2 832 cm-1處的吸收峰可以分別為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰，在1 654，1 449，1 414，1 021 cm-1的吸收峰為苯環的特征吸收峰。這些光譜數據與標準品數據一致，也與文獻報道[20]的大致一致，說明為吳茱萸堿。

由圖18可以看出，色譜斑點B與吳茱萸堿標準品有相似之處。在2 943 cm-1和2 832 cm-1處的吸收峰可以分別歸屬為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰，在1 449，1 415，1 115，1 022 cm-1的吸收峰為苯環的特征吸收峰，這與吳茱萸堿標準品有相似之處。但不完全相同，在2 318 cm-1處的峰可能為甲醇中的羥基峰，在1 654 cm-1左右沒有出現的C=O的特征吸收峰。故推測斑點2可能為吲哚類其他物質。

色譜斑點C紅外光譜圖（甲醇）見圖19。

圖19 色譜斑點C紅外光譜圖（甲醇）

由圖19可以看出，色譜斑點C與斑點B的紅外光譜圖相似，同樣有歸屬為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰（2 943 cm-1和2 832 cm-）1，在1 449，1 415，1 115，1 022 cm-1的苯環的特征吸收峰。沒有在1 654 cm-1左右出現的C=O的特征吸收峰。所以，推測斑點3可能為吲哚類其他物質，也可能為別的生物堿化合物。

2.5 比旋光度和熔點檢測與分析

譜斑點的旋光度及比旋光度見表2，色譜斑點及吳茱萸堿標準品的熔點見表3。

表2 色譜斑點的旋光度及比旋光度

表3 色譜斑點及吳茱萸堿標準品的熔點

3 結論

按料液比1∶30（m/V）加75%甲醇溶液，于超聲波微波組合萃取儀中分3個階段處理。每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，分別設置溫度為40，45，50℃；超聲波功率為850，900，800 W；微波功率為100，200，300 W；超聲波頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉速900 r/min。新鮮核桃青皮、葉和枝中的吳茱萸堿含量依次是50.13，16.67，8.06 mg/100 g。新鮮核桃青皮和葉中所含物質種類較多，枝和陳葉中物質單一。試驗過程中發現舊葉中幾乎全是紅色物質，而新葉中物質比較豐富，枝中物質較少。舊葉和新葉的不同，可能是舊葉被氧化的緣故。

在甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚展開劑配比為2∶16∶2∶5（V/V）；1∶9∶2∶5（V/V）；1∶8∶2∶6（V/V）和1∶8∶2∶6（V/V）下，核桃青皮、新葉、舊葉和枝條樣品展開效果良好，色譜斑點清晰；供試樣品與吳茱萸堿標準品色譜斑點位置一致。TLC分離、純化技術能適應不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強的適應性，為從復雜的天然產物粗制品中提取不同特性（如不同極性）的有效成分提供了有利條件。

供試樣品與吳茱萸堿標準品的最大質荷比（m/z）為305，有相同的碎片丟失。質譜圖中除包含與吳茱萸堿相符的碎片離子峰外，存在其他多個碎片離子峰或者基峰，推測原因有三：其一選擇的離子源不合適，導致打出的碎片雜多；其二在電轟擊過程中，產生了成倍的碎片離子峰；其三分離純化程度不夠，進入質譜的樣液尚存在雜質。

供試樣品與吳茱萸堿標準品在3 280 cm-1處有N-H的伸縮振動吸收峰，1 654 cm-1處有C=O的特征吸收峰，2 944 cm-1和2 832 cm-1處分別歸屬為CH3和CH2上的C-H伸縮振動吸收峰，1 654，1 449，1 414，1 021 cm-1處出現苯環的特征吸收峰；與吳茱萸堿Rf值相近的未知斑點，可能是其他吲哚類化合物。紅外圖譜中，洗脫物的特征峰除與對照品一致外，還有其他峰，但峰面積較小，影響較小，分析可能是TLC分離物中還有些許雜質，或者是吲哚類化合物中以吳茱萸堿為母核以外的結構，這需要進一步查閱文獻并進行后續的研究。

薄層層析-質譜-紅外（TLC-CMS-IR）在生物活性物質分離純化中具有操作簡便、容易掌握、回收率高、重現性好、分離效率高、分離量較大等特點。TLC-CMS-IR聯用有望在標準品的制備、天然產物化學成分研究及新藥篩選、評價、分析或質控需求等領域得到更廣泛的應用。