基于微滴數字PCR技術鑒別豬肉摻假方法的建立及評估

王溪橋，解迎雙，周小平，丁功濤，馬忠仁，Nurul Izza Nordin

（1.蘭州海關技術中心，甘肅 蘭州730010；2.西北民族大學，甘肅 蘭州730124；3.Industrial Biotechnology Research Centre，SIRIM Berhad）

0 引言

由于食品食譜和飲食習慣的快速變化，食品安全在當今世界引起了極大的關注，而肉及肉制品的摻假一直是世界性問題，在商業加工肉類中識別豬肉是食品工業中最關鍵的問題之一。因此，需要開發一種準確的豬肉檢測方法，防止食品摻假[1]，用于識別肉制品中豬肉，現有檢測方法依賴于蛋白質或DNA分析。基于蛋白質的分析方法包括免疫學分析、色譜法和肽檢查[2]。但是，基于蛋白質的分析方法可能不適用于加工的肉制品，因為蛋白質可能在加工過程中變性。而基于DNA的分析，如聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），Real time PCR，PCR限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）等在識別假冒肉類產品中的使用更為頻繁，因為這些方法可以檢測少量的DNA并擴增特定的靶區域，而且基于DNA的分析還具有許多優勢，包括簡單、快速、敏感和特異性[3]。試驗采用微滴數字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）技術，設計擴增豬基因組DNA特定區域的引物和探針，建立豬源性肉的檢測方法并評估了這種方法的特異性和靈敏性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有肉品材料均購自于北京美廉美超市，所有肉類均選用新鮮組織的肌肉組織，研究前將所有肉品的肥肉和結締組織去除；QuantiTMPicoGreen R dsDNA Kit試劑盒，英濰捷基（上海）貿易有限公司提供；ddPCR Master、MixDroplet Generation、Oil-Dr oplet Reader Oil，美國伯樂公司提供；快速DNA提取檢測試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司提供；引物和探針，上海英濰捷基公司合成。

1.2 主要儀器

Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白檢測儀（Thermo Scientific，美國）；QX100 Droplet Digital PCR系統包括微滴生成儀和微滴讀取儀（Bio-Rad,美國）。

2 試驗方法

2.1 DNA提取

肉類肌肉組織基因組DNA的提取參照快速DNA提取檢測試劑盒說明書進行，提取的DNA通過超微量核酸蛋白檢測儀檢測濃度和純度。

2.2 ddPCR反應

以豬源性內標準基因（NC_010454.3）為檢測目標，以FAM標記的探針進行定量檢測，探針序列為：5'-FAM-TCACAGGCGTGGGCTTTCTGC-BHQ1-3'，上游引物序列為：5'-ACCCAGACGAACTGCTCA A-3'，下游引物序列為：5'-TGGCGTCACTGATAGGT AAAT-3'。ddPCR反應包括配制體系、生成微滴、擴增循環和信號讀取4個步驟。ddPCR體系：10 μL 2×ddPCR Master Mix，10 μmol/L豬源性特異性正向引物和反向引物各1 μL、探針0.5 μL，DNA模板2 μL（模板質量濃度精確至40 ng/μL），ddH2O補至20 μL。生成微滴：將20 μL PCR體系和70 μL微滴生成油（droplet generation oi）l加入微滴生成卡，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴，鋪板至96孔PCR板。擴增循環：94℃，10 min預變性；94℃15 s，60℃60 s，45個循環，擴增結束后進行98℃、10 min的熱失活，每個模板重復5個平行檢測孔。信號讀取：將擴增的96孔板置入微滴讀取儀中讀取信號，使用軟件QuantaSoft V1.3.2.0分析試驗數據，獲得絕對定量數值。

2.3 豬源性ddPCR檢測體系特異性檢測

以豬的肌肉組織為研究靶標，選取不同物種的羊肌肉組織、牛肌肉組織、馬肌肉組織、驢肌肉組織、鴨肌肉組織、鵝肌肉組織和兔肌肉組織為特異性鑒定的研究對象，驗證試驗中豬源性ddPCR檢測方法的特異性，所有組織進行ddPCR反應方法與2.2中反應體系相同。

2.4 豬源性ddPCR檢測體系定量范圍及檢測限驗證

定量范圍是指試驗中ddPCR檢測方法所能實現穩定定量檢測的豬源性基因拷貝數范圍。根據現階段較為通用的質控標準要求，定量檢測范圍內的點應滿足線性擬合標準曲線，標準曲線線性相關系數＞0.95，并且所有組內檢測值的相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）＜25%。由全式金公司合成豬源性內標準基因擴增序列，并構建至pEASY-T5-Pork標準質粒，質粒經過超微量核酸蛋白檢測儀測定濃度（ng/μL），以（6.02×102）3×（ng/μL×10-）9/（DNA堿基長度×660）=拷貝數（copies）/μL計算出標準質粒濃度下的靶標基金拷貝數，通過將原始質粒分子進行梯度稀釋，得到理論拷貝數分別為2 000，1 000，200，100，20，10，2，0 copies/μL的標準質粒溶液，以此為DNA模板，參照2.2中ddPCR反應方法進行上機檢測，進行豬源性ddPCR檢測體系定量范圍及檢測限的驗證。

2.5 豬源性ddPCR檢測體系在摻雜量樣本中的驗證

建立豬肉和羊肉的混合樣本，其中豬肉成分占比分別為100%，10%，5%，1%，0。參照2.1提取DNA，以此為模板，通過2.2數字PCR反應進行上機檢測，以ddPCR的定量計算方式得到混合樣品中豬源性贗本的實際樣品拷貝數，以《轉基因動物及其產品成分檢測豬內標準基因定性PCR方法》（農業部2122號公告-1-2014）標準方法為對照，驗證豬源性ddPCR檢測體系的靈敏度和穩定性。

2.6 結果的計算與統計

ddPCR是一種絕對定量技術，不需要建立標準曲線，可直接測得待測樣中靶標基因的絕對拷貝數。

ddPCR的計算公式為：

式中：A——反應體系中目標分子的拷貝數；

X——數字PCR的陽性體系數；

N——總體系數。

計量資料描述以均數±標準差（X±s）表示。

3 結果與分析

3.1 豬源性ddPCR檢測體系特異性驗證結果

微滴讀取儀熱點圖顯示，豬源性ddPCR檢測體系在其他的物種中無擴增現象，特異性可以滿足實際檢測工作。

豬源性數字PCR檢測體系特異性驗證見圖1。

圖1 豬源性數字PCR檢測體系特異性驗證

3.2 定量范圍及檢測限驗證結果

ddPCR反應熱點可以看出，ddPCR反應陽性點與陰性點的區分非常明顯，結果穩定性和重復性較好，試驗結果不會受到熒光閾值限變化的影響。

不同豬源性基因拷貝數含量下數字PCR反應熱點圖見圖2。

圖2 不同豬源性基因拷貝數含量下數字PCR反應熱點圖

ddPCR檢測體系在10～2 000 copies/μL的范圍內具有較高的檢測線性，根據標準質粒已知拷貝數求得標準曲線為Y=1.058X-11.48，R2值為0.991 3大于0.95，根據實際檢測拷貝數求得不同組內的RSD值小于25%；由于數字PCR的方法在較高濃度下同樣具有較高的精確性和穩定性。因此，未進行檢測上限的驗證；在模板為2 copies/μL的檢測管中可以出現陽性結果，但是所有平行重復不全為陽性，所有檢測下限定體系為10 copies/μL。

豬源性基因拷貝數數字PCR定量結果分析見表1。

表1 豬源性基因拷貝數數字PCR定量結果分析

3.3 豬源性ddPCR檢測體系在摻雜量樣品驗證結果

以混合樣品進行稀釋豬源性樣品，結果顯示檢測方法可以特異性地識別不同成分含量混合樣品中的豬源性成分，并且相比標準方法，具有更高的靈敏度和穩定性。

雙重數字PCR實際樣品檢測結果見表2。

表2 雙重數字PCR實際樣品檢測結果

4 結論

對于摻假肉檢驗而言，由PCR技術興起的DNA檢測技術發展的最為迅速[4]。相對于蛋白標志物而言，DNA分子具有優秀的穩定性，而且依據基因保守序列的特異性，鑒定不同物種在基因組DNA層面較易實現。PCR技術具有級聯放大、特異性強、敏感性強的優勢，只要給予模板，根據特異性的引物就可以識別特異性的物種，在PCR技術平臺上發展了很多種檢測技術。多重PCR即在反應體系中加入多個物種檢測特異性引物，蘇葳藝等人[5]利用多重PCR方法可同時檢測牛肉中摻雜雞肉、豬肉、鼠肉任意3種肉類混合樣品，且檢出限均達到1%的摻雜量。環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種核酸等溫擴增技術，可在反應過程中加入相應的染料，建立可視化的簡易擴增技術。Ya Shi等人[6]采用LAMP方法，結合羥萘酚藍染料，建立了鴨肉的檢測方法，顯示與其他4種肉類無交叉反應，敏感性可檢測3 pg鴨肉DNA。基于免疫側向層析（Lateral-flow strip(LFS）)技術平臺，將PCR擴增的產物進行標記，偶聯至快速檢測條載體上，從而實現快遞檢測及可視化的目的。Panzhu Qin等人[7]利用FITC和生物素修飾的引物組對摻假鴨肉的目標DNA進行現場擴增，從而產生大量雙鏈DNA（dsDNA）用FITC和生物素雙重標記的產品。產品的FITC標記的末端與檢測條測試線上預先固定的FITC抗體結合，生物素標記的末端與鏈霉親和素結合的金納米粒子結合，從而在LFS上形成可見的檢測線用于快速鑒別摻假牛肉中的鴨肉，可以檢出低至0.05%的摻假率。而普通PCR只能用于定性檢測，Real time PCR技術可實現定量檢測。Li Ting Ting等人[8]設計了新型的基于參考引物的實時PCR方法，用于定量測定摻入豬肉的山羊肉，通過計算Ct的比率（特異性/參考值），可以推斷出摻入豬肉的含量。為了提高Real time PCR技術的靈敏性，基于TaqMan探針的Real time PCR技術應用在檢測領域。Fang X等人[9]對嚙齒動物鼠類靶標基因線粒體細胞色素b基因（cytb）設計TaqMan探針進行檢測，顯示最低檢測下限為0.25 pg DNA時即可完成檢測，而肉類摻雜量低至0.1%。

經典PCR可用于定性或定量研究靶分子的性質或確定靶分子的數量，ddPCR的不同之處在于在微滴中將樣品分配到單個分子的水平，然后進行PCR擴增，獲得全或無信號，即數字信號，并使用泊松分布（Poisson Distribution）分析靶分子的性質或計算靶分子的數目[10]。因為ddPCR技術具有更高的靈敏度和準確性，其獨立于標準曲線迅速發展，已廣泛應用于下一代測序和檢測領域，如基因突變、拷貝數變異、微生物和轉基因食品。有研究證實ddPCR方法，用于定量測定綿羊和山羊肉產品中雞肉的含量，與Real time PCR相比，ddPCR的性能更精確、靈敏和穩定[11]。試驗針對ddPCR技術平臺，設計了豬源性肉類的檢測方法，結果顯示特異性較強，在羊、牛、馬、驢、鴨、鵝和兔物種無交叉，針對檢測限進行了標準質粒DNA系列梯度的擴增，發現數字PCR檢測體系在10～2 000 copies/μL的范圍內具有較高的檢測線性，R2值為0.991 3大于0.95，RSD值小于25%，盡管為2 copies/μL的檢測管中可以出現陽性結果，但是所有平行重復不全為陽性，摻雜量檢出中與標準Real time PCR方法進行了對比，顯示在摻雜量為1%的樣本中擁有很好的靈敏度和穩定性。因此，試驗中建立的基于ddPCR的檢測方法在實際應用中具有十分重要的價值。

隨著市場的快速多元化發展，應該充分利用技術進步和儀器領域的提升開辟新的路徑，建立高效準確摻假肉檢測方法，讓摻假肉鑒別技術在快速檢測的同時，盡可能地保證高特異性和高靈敏度，實現各種摻雜量情況下均可準確得出摻雜量比例，為廣大消費者及執法部門提供安全、快速、準確的檢測結果，為肉類食品安全和肉類食品消費提供保障。