褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松葉綠素及抗氧化酶活性的影響

孫鳳萍

（山西省林業(yè)和草原資源調(diào)查監(jiān)測(cè)中心，山西 太原030012）

當(dāng)前全球鹽漬化耕地面積達(dá)到了全部耕地面積的20%[1]，我國(guó)鹽漬化耕地面積也達(dá)到了9913萬(wàn)hm2[2]。NaCl脅迫會(huì)使植物膜系統(tǒng)受到破壞，影響植物的正常生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡[3]。油松是我國(guó)很多山區(qū)造林和城鎮(zhèn)綠化應(yīng)用較多的樹種之一，幼苗與成年樹相比耐NaCl脅迫能力差，土壤的鹽漬化嚴(yán)重影響了油松育苗工作和營(yíng)林造林工作順利進(jìn)行[4]。褪黑素（melatonin，MT）1958年首次分離得到，可以緩解非生物脅迫下逆境對(duì)植物的傷害，提高植物抗逆能力[5]。褪黑素具有清除鹽脅迫下植物體內(nèi)多余活性氧的能力，同時(shí)提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[1]，適宜濃度的褪黑素可以顯著降低鹽脅迫下芹菜的MDA含量，降低活性氧的危害[6]，提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受能力。杜卓[7]研究認(rèn)為，褪黑素可以顯著提高干旱脅迫下植物體內(nèi)葉綠素含量，有利于提高植物光合能力和逆境適應(yīng)能力，促進(jìn)生長(zhǎng)；杜天浩[8]研究認(rèn)為，褪黑素顯著提高了NaCl脅迫下番茄葉綠素含量和抗氧化酶活性，有利于植株清除多余的活性氧以降低NaCl脅迫對(duì)番茄的傷害；王麗英[9]研究認(rèn)為，褪黑素提高了黃瓜植株內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量，有效緩解了NaCl脅迫造成的膜脂質(zhì)過氧化作用，顯著提高了黃瓜的耐鹽性；向警[1]研究認(rèn)為，適宜濃度的褪黑素顯著提高了NaCl脅迫下水稻幼苗的SOD、POD、CAT活性，增強(qiáng)了水稻抗氧化能力，緩解了NaCl脅迫造成的氧化損傷；張海文[10]研究認(rèn)為，外源褪黑素可以提高油松抗氧化酶活性，但是外源褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松葉綠素含量和抗氧化酶活性變化的相關(guān)研究并未涉及。本文研究了不同濃度的褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松的葉綠素和抗氧化酶活性變化，以期為利用褪黑素緩解油松苗木NaCl脅迫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年4月至7月在山西省林業(yè)和草原資源調(diào)查監(jiān)測(cè)中心實(shí)驗(yàn)苗圃內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)所選油松為2a生實(shí)生苗，該苗木于2018年3月2日浸種3d，3月6日播種入穴盤中，出苗后養(yǎng)護(hù)至6月20日，將苗木移栽入長(zhǎng)×寬×高為35cm×30cm×35cm的塑料栽植盆內(nèi)。每盆裝土20kg，每盆栽1株。苗木生長(zhǎng)期間正常養(yǎng)護(hù)，防止出現(xiàn)旱澇災(zāi)害及病蟲危害。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，T1為空白對(duì)照，無NaCl脅迫和褪黑素，T2為NaCl脅迫對(duì)照，NaCl濃度為200mmol/L；T3為NaCl+低濃度褪黑素，NaCl濃度200mmol/L+50μmol/L褪黑素；T4為NaCl+中等濃度褪黑素，NaCl濃度200mmol/L+100μmol/L褪黑素；T5為NaCl+高濃度褪黑素，NaCl濃度200mmol/L+150μmol/L褪黑素。其中，T2、T3、T4、T5處理NaCl灌入量為2000mL/盆，分兩次處理，即4月15日澆入1000mL，5月15日澆入1000mL。褪黑素共處理2次，第一次為4月22日至25日連續(xù)3d噴施，每天噴施量為50mL/株；第二次為5月22日至25日，每天噴施量為50mL/株，噴施時(shí)間為下午18：00以后。T1處理在4月15日和5月15日分別澆入1000mL的蒸餾水，T1、T2處理在4月22日至25日、5月23日至26日每天噴施50mL/株的清水。每處理共設(shè)置20盆，3次重復(fù)。整個(gè)試驗(yàn)期間防止病蟲危害和旱澇災(zāi)害。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

分別于5月5日、5月20日、6月5日、6月20日取樣，每處理選取6株油松苗木，每2株作為一個(gè)重復(fù)，剪取葉片2g，取0.5g用于測(cè)定葉綠素含量，其余葉片放入液氮中冷凍30min后轉(zhuǎn)入-40℃冰箱中保存，用于測(cè)定抗氧化酶活性。其中，葉綠素含量測(cè)定采用浸提法[11]，SOD活性測(cè)定采用NBT還原法[12]，POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[12]，CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法[12]。各項(xiàng)指標(biāo)分別測(cè)定5次，取平均值作為最后結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖表制作及數(shù)據(jù)處理均使用Excel2010版軟件，方差分析使用DPS7.05版軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松葉綠素a含量的影響

由圖1可知：NaCl脅迫在整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著降低了油松葉片內(nèi)的葉綠素a含量，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了葉綠素a含量，不同濃度的褪黑素對(duì)葉綠素a含量的影響不同。整個(gè)試驗(yàn)期間，T4葉綠素a含量處于最高值，與T2處理相比分別提高了0.43mg/g、0.48mg/g、0.57mg/g、0.92mg/g，差異顯著，表明100μmol/L褪黑素與NaCl處理相比顯著提高了油松葉片內(nèi)的葉綠素a含量。5月5日至6月5日，3個(gè)濃度的褪黑素處理葉綠素a含量處于同一水平，表明不同濃度的褪黑素在該時(shí)間段內(nèi)不會(huì)對(duì)油松葉綠素a含量產(chǎn)生顯著影響。6月20日，T4分別高于T1、T2、T3處理0.6 5mg/g、0.92mg/g、0.57mg/g，差異顯著，表明100μmol/L與50μmol/L褪黑素處理相比在6月20日對(duì)提高葉綠素a含量效果達(dá)到了顯著水平；T5低于T4處理0.16mg/g，無顯著差異，表明褪黑素含量從T4提高至T5對(duì)葉綠素a含量的影響不顯著。

圖1 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松葉綠素a含量的影響

2.2 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松葉綠素b含量的影響

由圖2可知：整個(gè)試驗(yàn)期間，NaCl處理與空白對(duì)照相比顯著降低了油松葉片內(nèi)葉綠素b含量，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了葉綠素b含量，不同濃度褪黑素處理對(duì)葉綠素b含量的影響存在差異。整個(gè)試驗(yàn)期間，T4分別高于T2處理0.50mg/g、0.65mg/g、0.60mg/g、0.72mg/g，差異顯著，表明100μmol/L褪黑素與NaCl處理相比具有顯著提高油松葉片內(nèi)葉綠素b含量的作用。整個(gè)試驗(yàn)期間T4均顯著高于T1，表明該濃度的褪黑素與空白對(duì)照相比有顯著提高油松葉片內(nèi)葉綠素b含量的作用；T3、T5與T1之間無顯著差異，表明這兩個(gè)濃度的褪黑素與空白對(duì)照相比不會(huì)對(duì)油松葉綠素b含量產(chǎn)生顯著影響。5月5日與6月5日，T3、T4、T5處理的葉綠素b含量處于同一水平，表明不同濃度的褪黑素在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)不會(huì)對(duì)葉綠素b含量產(chǎn)生顯著影響；5月20日和6月20日，T4葉綠素b含量分別高于T3處理0.33mg/g、0.39mg/g，差異顯著，表明在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)褪黑素濃度由100μmol/L降低至50μmol/L會(huì)顯著降低油松葉片內(nèi)葉綠素b含量。T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度由T4提高至T5不會(huì)對(duì)油松葉綠素b含量產(chǎn)生顯著影響。

圖2 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松葉綠素b含量的影響

2.3 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松SOD活性的影響

由圖3可知：NaCl處理與空白對(duì)照相比顯著提高了油松SOD活性，褪黑素處理與NaCl處理相比同樣提高了油松葉片內(nèi)SOD活性。從試驗(yàn)結(jié)果來看，5月5日至6月20日，T4與T2相比SOD活性分別提高了26.92%、24.42%、33.10%、32.44%，差異顯著，表明100μmol/L的褪黑素與NaCl處理相比顯著提高了油松葉片內(nèi)SOD活性；T3與T2處理之間無顯著差異，表明50μmol/L的褪黑素不能顯著提高NaCl脅迫下油松的SOD活性；5月20日至6月20日，T4顯著高于T3處理，表明褪黑素濃度從50μmol/L提高至100μmol/L會(huì)顯著提高NaCl脅迫下油松葉片內(nèi)的SOD活性；T5在整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著高于T2處理，表明150μmol/L的褪黑素同樣可以顯著提高NaCl脅迫下油松葉片內(nèi)SOD活性；T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度從100μmol/L提高至150μmol/L不會(huì)對(duì)油松SOD活性產(chǎn)生顯著影響。

圖3 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松SOD活性的影響

2.4 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松POD活性的影響

由圖4可知：NaCl處理與空白對(duì)照相比提高了油松葉片的POD活性，其中5月5日T2與T1之間無顯著差異，5月20日至6月20日兩個(gè)處理之間存在顯著差異，表明NaCl脅迫會(huì)顯著提高油松葉片內(nèi)的POD活性。噴施褪黑素與NaCl處理相比，在整個(gè)試驗(yàn)期間均提高了油松葉片內(nèi)POD活性，不同濃度的褪黑素對(duì)油松POD活性的影響存在差異。整個(gè)試驗(yàn)期間，T4與T2相比POD活性分別提高了48.29%、40.06%、36.48%、52.30%，差異顯著，表明100μmol/L的褪黑素與NaCl處理相比會(huì)顯著提高油松葉片內(nèi)的POD活性。T3與T2相比分別提高了7.89%、12.80%、13.02%、20.17%，無顯著差異，表明50μmol/L的褪黑素與NaCl脅迫處理相比不能顯著提高油松葉片內(nèi)的POD活性。5月5日和6月5日，T5分別高于T4處理0.43U/g、0.38U/g，無顯著差異，5月20日和6月20日T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度從100μmol/L升高至150μmol/L不會(huì)對(duì)油松POD活性產(chǎn)生顯著影響。

圖4 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松POD活性的影響

2.5 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松CAT活性的影響

由圖5可知：NaCl脅迫下，油松葉片內(nèi)的CAT活性顯著升高，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了CAT活性，但是不同濃度的褪黑素對(duì)油松CAT活性影響存在差異。5月5日，T4比T2處理提高了18.42%，差異顯著，T3、T5與T4之間無顯著差異，表明不同濃度的褪黑素在處理后10d對(duì)油松CAT活性的影響處于同一水平，T3、T5與T2之間無顯著差異，表明T3、T5在5月5日與T2相比不會(huì)對(duì)油松CAT活性產(chǎn)生顯著影響。5月20日至6月20日，T4與T2相比分別提高了20.51%、28.08%、24.22%，差異顯著，表明100μmol/L的褪黑素與NaCl處理相比會(huì)使油松葉片內(nèi)CAT活性顯著升高；T3分別低于T4處理4.71U/g、6.19U/g、7.05 U/g，差異顯著，表明褪黑素濃度從100μmol/L降低至50μmol/L會(huì)使油松CAT活性顯著降低；T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度提高至150μmol/L不會(huì)對(duì)油松葉片內(nèi)CAT活性產(chǎn)生顯著影響。

圖5 褪黑素對(duì)NaCl脅迫下油松CAT活性的影響

3 討論與結(jié)論

NaCl脅迫會(huì)直接影響植物的葉綠素代謝過程，長(zhǎng)時(shí)間的NaCl脅迫會(huì)降低葉綠素的合成量和提高葉綠素降解速率，從而導(dǎo)致葉片內(nèi)葉綠素含量降低[13]。本試驗(yàn)中，油松葉片內(nèi)葉綠素a、b含量在NaCl脅迫下會(huì)顯著降低，而褪黑素處理的葉綠素a和葉綠素b含量均顯著升高，這與羅黃穎[14]的研究結(jié)果相似，分析原因認(rèn)為可能與褪黑素可以緩解NaCl脅迫下葉綠素合成障礙，同時(shí)降低葉綠素降解速率有關(guān)。

植物在NaCl脅迫條件下體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，從而使細(xì)胞膜遭受破壞和代謝紊亂，導(dǎo)致植物體早衰，甚至死亡[15]。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套清除過多活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)，SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)最重要的3種抗氧化酶，對(duì)清除植物體內(nèi)多余的活性氧和防止膜系統(tǒng)受到破壞起著重要作用[16]。本試驗(yàn)結(jié)果中，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了油松葉片內(nèi)的SOD活性，這與喬沛[17]的研究結(jié)果相似，表明褪黑素對(duì)提高植物體內(nèi)SOD活性，降低NaCl脅迫危害具有重要作用。

從POD活性變化上來看，50μmol/L的褪黑素與100μmol/L處理相比顯著降低了油松葉片內(nèi)的POD活性，并且50μmol/L的褪黑素處理與NaCl脅迫處理的POD活性無顯著差異，說明50μmol/L的褪黑素并未顯著提高油松POD活性，這與陳莉[18]的研究結(jié)果不同，分析原因認(rèn)為這可能與褪黑素對(duì)植物不同器官的作用存在差異有關(guān)。褪黑素濃度從100μmol/L提高至150μmol/L時(shí)，POD濃度在5月20日和6月20日表現(xiàn)出降低的變化，這與彭玲[19]的研究結(jié)果一致，說明高濃度的褪黑素會(huì)降低植物體內(nèi)POD活性。CAT活性變化與POD相似，100μmol/L的褪黑素顯著提高了NaCl脅迫下油松葉片內(nèi)的CAT活性，這與何松榆[20]的研究結(jié)果一致，表明褪黑素可以顯著提高NaCl脅迫下的油松葉片內(nèi)抗氧化酶活性，防止活性氧的積累導(dǎo)致油松膜系統(tǒng)受到傷害，從而維持正常生理生化過程的進(jìn)行。綜上分析來看，100μmol/L的褪黑素可以顯著提高NaCl脅迫下油松葉片內(nèi)葉綠素含量和抗氧化酶活性。