UHPLC-Q-TOF/MS鑒定大鼠體內隱綠原酸的代謝產物

李 芳，李 潔，王喻淇，董 凡，陶雨凡，王少平，張加余*

UHPLC-Q-TOF/MS鑒定大鼠體內隱綠原酸的代謝產物

李 芳1，李 潔2，王喻淇2，董 凡2，陶雨凡3，王少平3，張加余3*

1. 北京市豐臺區婦幼保健院 藥劑科，北京 100069 2. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488 3. 濱州醫學院藥學院，山東 煙臺 264003

定性分析隱綠原酸在大鼠血漿、尿液和糞便中的代謝產物。大鼠給予隱綠原酸后，采集血液、尿液和糞便并進行樣品處理，采用UHPLC-Q-TOF/MS法檢測各生物樣品中的代謝產物。通過相應的色譜保留行為、精確相對分子質量、特征碎片離子、質譜裂解規律、文獻報道以及對照品比對，最終分析鑒定了47個代謝產物。其主要體內代謝途徑為水解反應、異構化反應、甲基化、氫化、葡萄糖醛酸化以及它們的復合反應。UHPLC-Q-TOF/MS法能較全面地鑒定隱綠原酸在大鼠體內的代謝產物，有助于進一步闡明隱綠原酸的藥效學物質基礎。

隱綠原酸；大鼠；UHPLC-Q-TOF MS；代謝產物鑒定；生物樣品

綠原酸類化合物（chlorogenic acids，CGAs）一般是指1個或多個有機酸（如咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸、芥子酸與奎寧酸或其衍生物莽草酸、奎寧酸甲酯或丁酯、4-去氧奎寧酸）縮合形成的酯。很多中藥材及其復方制劑均富含綠原酸（5--咖啡酰奎尼酸）、隱綠原酸（4--咖啡酰奎尼酸）和新綠原酸（3--咖啡酰奎尼酸）等綠原酸類成分[1-3]。近年來，它們憑借著顯著的抗炎、抗菌和抗病毒藥理活性而廣受關注[4-6]。

中藥體內代謝以及藥動學研究是闡明中藥復雜體系作用模式的重要途徑，也是中藥現代化研究的難點和重點。很多臨床有效的中藥，進入人體發揮藥效的物質基礎及其體內過程尚不明確，嚴重影響了中醫藥的現代化進程。作為中藥物質基礎基本單元的單體成分，其體內代謝過程的闡明對于中藥起效物質基礎和作用靶點等重要科學問題的揭示具有重要意義。目前，綠原酸的體內吸收代謝過程已相對清晰[7-11]，而綠原酸的同分異構體之一——隱綠原酸的體內分布代謝研究卻未見報道。本研究利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UHPLC-Q- TOF/MS）系統分析了隱綠原酸在大鼠體內（血漿、尿液及糞便）的代謝產物及代謝途徑，以期全面地反映隱綠原酸在生物體內的藥效物質基礎，并為其后續的臨床研究提供依據。

1 材料

1.1 藥品與主要試劑

隱綠原酸（批號PRF8010501）、新綠原酸（批號PRF8050442）、奎尼酸（批號PRF8060823）和咖啡酸（批號PRF7102044）均購自成都普瑞法科技開發有限公司；綠原酸（批號110753-200413）和阿魏酸（批號110773-201313）購于中國食品藥品檢定研究院；所有對照品經HPLC-UV檢測質量分數均大于98%。甲酸（色譜級，德國Merck公司），乙腈和甲醇（質譜級，美國Thermo Fisher公司）。SPE Cartridges C18固相萃取小柱（500 mg/3 mL，Grace PureTM公司）。

1.2 儀器

Exion LCTMAC液相色譜儀與X500R QTOF質譜，配有雙噴霧Turbo V離子源，SCIEX OS 1.3工作站（AB SCIEX公司）；R200D型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；Millipore Synergy UV型超純水機（美國Millipore公司）；KQ-250 DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，體質量（200±10）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。動物實驗經北京中醫藥大學動物實驗中心審查批準（倫理審查號Bucm-4-2018062602-3039）。

2 方法

2.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取上述6個對照品適量，加甲醇制成質量濃度為100 μg/mL的儲備液。吸取各對照品儲備液100 μL，最終加甲醇定容至1 mL，制成質量濃度約為10 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2 色譜條件

Waters HSS T3 UPLC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；洗脫梯度：0～6 min，2%～10% A；6～10 min，10%～25% A；10～15 min，25%～35% A；15～16 min，35%～40% A；16～20 min，40%～80% A；20～21 min，80%～95% A；21～24 min，95% A；柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量5 μL。

2.3 質譜條件

HESI負離子模式，離子源溫度550 ℃，電離源電壓4.5 kV，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度＞99.99%），鞘氣體積流量35 arb，掃描模式：Full MS/dd-MS2；數據依賴性ddMS2采集，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，高分辨掃描范圍/100～1000，碰撞能為30 eV。

2.4 給藥樣品的制備

稱取隱綠原酸200 mg，加入8 mL生理鹽水，超聲至充分混懸，配制成質量濃度為25 mg/mL的給藥溶液，用前保存于4 ℃冰箱中。

2.5 動物實驗與生物樣品采集

8只SD大鼠（隨機分組，空白組和給藥組各4只），飼養于溫度為22～26 ℃、濕度為40%～70%、12 h晝夜更替的SPF級動物室內。實驗前適應性喂養7 d，受試前禁食12 h，全程不禁水。給藥組ig給予隱綠原酸藥液200 mg/kg，空白組ig給予等量的生理鹽水。空白組和給藥組大鼠分別于ig后0.5、1、2、4 h時間點眼眶取血0.5 mL，置于肝素鈉抗凝EP管中，混合均勻，3500 r/min離心10 min，分別合并4個時間點的血漿，即得空白血漿和含藥血漿，于?80 ℃冰箱保存，備用。

空白組和給藥組ig給藥后24 h內，每隔6 h收集一次尿液和糞便，分別合并。空白組和給藥組尿液4000 r/min離心10 min，取上清液于?80 ℃冰箱中保存；空白組和給藥組糞便樣品分別晾干后碾碎，置于?80 ℃冰箱中凍存。

2.6 生物樣品的處理

取固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3 mL水對其進行活化。分別吸取室溫下解凍的空白組和給藥組的血漿和尿液生物樣品2 mL上樣，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，分別制備空白組和給藥組的血漿和尿液樣品；取空白組和給藥組糞便樣品適量，按照1∶5比例加入去離子水，超聲處理60 min，3500 r/min離心10 min，取上清液加到預處理好的固相萃取小柱，用3 mL水沖洗雜質，再用3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，分別制備空白組和給藥組的糞便樣品。

將上述所有甲醇洗脫液，在常溫下用N2吹干，殘渣用初始流動相定容至100 μL，渦旋3 min后，再14 000 r/min離心15 min。取上清液，注入UHPLC-Q-TOF-MS進行分析。

3 結果

3.1 高分辨質譜數據的預處理

所有數據采集和處理均在SCIEX OS 1.3.1工作站進行。基于藥物的代謝產物通常具有相同或者相似的母核結構，可采用數據采集的質量虧損過濾（MDF）軟件進行篩選追蹤主要的代謝產物。基于母藥隱綠原酸的化學結構，設置了如下MDF模板：母藥隱綠原酸（/353.086 7）及其核心結構咖啡酸和奎寧酸（/179.033 9、/191.055 0）；隱綠原酸谷胱甘肽結合產物（/660.171 5）、糖基化產物（/515.140 4）、葡萄糖醛酸結合產物（/529.119 9）和磺酸化產物（/433.043 5）等。MDF窗口設置為±0.05。

根據精確相對分子質量、元素組成和可能發生的反應，對所有的母離子和碎片離子的分子式進行預測。相關參數設置為：C [0-30]，H [0-50]，O [0-30]，S [0-2]，N [0-3]，環不飽和雙鍵數（RDB equivalent value）[0-15]，質量精度誤差在1×10?5以內。

3.2 隱綠原酸在大鼠體內的代謝產物分析鑒定

基于UHPLC-Q-TOF分析空白組和給藥組的大鼠血漿、尿液和糞便樣品。通過對比給藥前后的生物樣品圖譜信息，結合色譜保留時間、精確相對分子質量、碎片離子、文獻報道以及對照品比對信息等，共鑒定了包括原型在內的47個代謝產物。其中，在給藥組血漿、尿液和糞便樣品中分別鑒定了13、38、18個代謝產物，具體的質譜信息見表1。

表1 大鼠生物樣品中隱綠原酸代謝產物的質譜信息

續表1

“＋”檢測到 “?”未檢測到*與對照品比對鑒定

“＋”detected “?” undetected*identified with reference standard

在負離子模式下，M11、M14、M17和M19產生相同的準分子離子峰/353.086 71 [M－H]?，推測其分子式為C16H17O9（誤差≤±2.00×10?6）。在其ESI-MS2譜中，它們均產生特征碎片離子/191.056 13（奎尼酸骨架離子）。其中，M11和M19的色譜保留時間和多級質譜裂解行為與相應的對照品基本相同。因此，分別將M11和M19準確鑒定為新綠原酸和綠原酸，同時將M14和M17鑒定為隱綠原酸的同分異構體[12-15]。

M20、M24和M32具有相同的準分子離子峰/179.035 26，推斷最可能的分子式為C9H7O4（誤差≤±2.00×10?6）。在其ESI-MS2譜中均可見特征碎片離子/135 [M－H－CO2]?，表明分子中存在羧基。通過與咖啡酸對照品的保留時間以及質譜裂解行為比對，可將M24準確鑒定為咖啡酸，并把M20和M32鑒定為咖啡酸同分異構體。M9、M16和M33的實驗相對分子質量均比咖啡酸多2，并產生相同的準分子離子峰/181.049 53 [M－H]?，推測其分子式為C9H9O4（誤差≤±2.00×10?6）。在ESI-MS2譜中，它們均可脫去1分子H2O（18）產生主要的碎片離子/163，并可中性丟失1分子CO2（44）產生碎片離子/137。因此，可將M9、M16和M33鑒定為二氫咖啡酸同分異構體。

M47的準分子離子峰為/357.078 55 [M－H]?，推測其分子式為C15H17O10，誤差為3.07×10?6。在ESI-MS2譜圖中，/357脫去1分子CO2（44）形成碎片離子/313。同時還檢測到碎片離子/181 [M－H－glucuronide－H2O]?。因此，推測M47是二氫咖啡酸的葡萄糖醛酸結合反應產物。其ESI-MS2裂解的產物離子/163 [M－H－glucuronide－2H2O]?，可進一步確認上述推斷。M6的準分子離子峰為/236.057 07 [M－H]?，推測其分子式為C11H10NO5，誤差為1.73×10?6。在其ESI-MS2譜中，/236分別中性丟失1分子C2H4NO2和C3H4NO3，生成碎片離子/162（[M－H－NH2CH2COO]?）和/134（[M－H－NH2CH2COO－CO]?），表明其分子中存在甘氨酸和羰基。參照文獻報道，可將其鑒定為咖啡酸的甘氨酸結合產物。

M23的色譜保留時間為9.08 min，準分子離子峰為/273.007 60 [M－H]?，推測其分子式為C10H9O7S。在其ESI-MS2譜圖中，/273相繼產生碎片離子/193 [M－H－SO3]?、/149 [M－H－SO3－CO2]?和/134 [M－H－SO3－CO2－CH3]?，表明其母核結構中存在羧酸、硫酸基團及甲氧基等。結合相關文獻報道，將M23鑒定為咖啡酸甲基化和磺酸化的復合產物。M4的準分子離子峰為/147.045 43 [M－H]?，推測其分子式為C9H7O2（誤差≤±2.00×10?6）。同時，M4的實驗相對分子質量比咖啡酸少32。在其ESI-MS2譜圖中，/147脫掉1分子CO2（44）生成碎片離子/103。結合文獻報道[16]，可將M4鑒定為肉桂酸。

M7的色譜保留時間為9.24 min，相對分子質量為261.006 35，推測其分子式為C9H9O7S（誤差≤±2.00×10?6）。在它的ESI-MS2譜中，/261脫掉1分子SO3（80）和1分子CO2（44），分別產生碎片離子/181 [M－H－SO3]?和/137 [M－H－SO3－CO2]?，表明其母核結構中存在羧基和磺酸基。因此，M7被鑒定為二氫咖啡酸磺酸化結合物。M29的準分子離子峰為/163.040 30 [M－H]?，推測其分子式為C9H7O3（誤差1.33×10?6）。它的實驗相對分子質量比咖啡酸少16，推測是咖啡酸的脫羥基產物。結合產生碎片離子/119 [M－H－CO2]?，將M29鑒定為咖啡酸的脫羥基產物香豆酸[17-18]。

M39的準分子離子峰為/135.045 40 [M－H]?，推測其分子式為C8H7O2（誤差為1.34×10?6）。在ESI-MS2譜中，其可中性丟失1分子CH3，產生二級碎片離子/120，表明其母核結構中存在甲基。結合相關文獻報道，將M39鑒定為咖啡酸脫羧產物。M45的色譜保留時間為13.53 min，準分子離子峰為/193.051 35 [M－H]?。根據精確分子質量推測其分子式為C10H9O4（質量誤差1.82×10?6）。在ESI-MS2圖譜中，/193依次丟失1分子CO2和1分子CH3，分別產生碎片離子/149和/134，推測其分子中存在羧基和甲基。通過與相應的對照品比對，將M45準確鑒定為阿魏酸。

M2的準分子離子峰為/191.056 14 [M－H]?，保留時間為0.93 min，分子式為C7H11O6。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子H2O和1分子CO2產生/173和/147。此外，中性丟失2分子H2O和1分子CO2產生/111 [M－H－CO2－2H2O]?。據此推斷M2分子中極有可能存在至少2個羥基和1個羧基。由于M2與奎尼酸對照品的色譜保留時間和質譜碎片相同，可將其準確鑒定為奎尼酸。

M12的準分子離子峰為137.023 32 [M－H]?，推測其分子式為C7H5O3，誤差為1.27×10?6。其相對分子質量比苯甲酸多16，推測M12可能是苯甲酸的羥基化產物。由于其ESI-MS2碎片離子/109 [M－H－H2O]?和/93 [M－H－CO2]?是通過中性丟失1分子CO2和1分子H2O分別產生的，表明其母核結構上存在羥基和羰基。因此，最終將M12鑒定為3-羥基苯甲酸。

M5和M8的準分子離子峰[M－H]?分別為167.034 9、167.035 4，并分別產生 ESI-MS2碎片離子/123和/149。其中，/167脫去1分子CO2產生/123，/167中性丟失1分子H2O產生/149。因此，可將二者鑒定為香草酸及其同分異構體[19]。

M27的準分子離子峰為/121.029 85 [M－H]?，分子式為C7H5O2。在其ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子CO產生碎片離子/93 [M－H－CO]?。因此將M27鑒定為羥基苯甲醛。M3的色譜保留時間為1.27 min，結合高分辨相對分子質量173.045 7，推測分子式為C7H9O5，其產生的碎片離子為/129、/155和/111。在負離子模式下，其準分子離子峰/173脫去1分子H2O產生/155，脫去1分子CO2產生/129，/155脫去1分子CO2生成/111，說明分子中存在羧基和羥基，由此將M3鑒定為莽草酸[20-21]。

M18的準分子離子峰[M－H]?為178.051 7，由氮規律推測其含有奇數個氮原子。結合精確相對相對分子質量推測其分子式為C9H8NO3，分別產生ESI-MS2碎片離子/134和/150等。其中，/150為/178脫去1分子CO產生的；/178中性丟失1分子CO2產生/134。因此，最后將其鑒定為馬尿酸[22]。

M26的準分子離子峰[M－H]?為179.071 59，推測其分子式為C9H8NO3，誤差為1.32×10?6。其ESI-MS2譜碎片離子/135可推測為[M－H]?離子中性丟失1分子CO2所產生的。因此，將M26推測為2-乙氧基苯甲酸甲酯。

M13在總離子流圖提取的準分子離子峰為/194.046 43 [M－H]?。結合精確其相分子質量推測其分子式為C8H8NO4，誤差為1.63×10?6。由于其相對分子質量較馬尿酸多16，并均產生碎片離子/135 [M－H－CO2－CH3]?和/150 [M－H－CO2]?，說明M13分子中存在羧基和甲基。因此，將其鑒定為3-羥基馬尿酸[22]。

M25、M35和M44的色譜保留時間分別為9.22、9.58、11.42 min。根據高分辨精確相對分子質量推測它們的分子式為C10H11O4，誤差均≤±2.00×10?6。在其ESI-MS2譜中，[M－H]?離子由于中性丟失1分子CH3和1分子CO2分別產生碎片離子/180和/151，表明分子中存在甲基和羧基。結合相關文獻報道，將其鑒定為二氫阿魏酸。

M1的準分子離子峰均/197.045 8 [M－H]?，結合高分辨精確相對分子質量推測其分子式為C9H9O5，誤差均為1.35×10?6。在ESI-MS2譜圖中，均可見碎片離子/167 [M－H－OCH2]?、/149 [M－OCH2－H2O]?和/121 [M－OCH2－H2O－CO]?，表明分子中存在甲氧基、羰基以及羥基。因此，將M1鑒定為丁香酸[19]。

M15的精確相對分子質量為/258.992 64，較M24相對分子質量多80，推測其分子式為C9H8NO3（誤差為0.84×10?6）。在其ESI-MS2譜圖中，/179[M－H－SO3]?表明分子中磺酸基團的存在。鑒于其裂解規律與咖啡酸裂解規律相近，可將M15推測為咖啡酸硫酸化產物。

M10、M28和M43的準分子離子峰為/355.102 35，根據高分辨精確相對分子質量推測它們的分子式為C16H19O9（誤差≤±5.00×10?6），其相對分子質量比綠原酸多2，且均產生/181、/173和/155，故將其鑒定為隱綠原酸氫化產物。

M21、M30、M37和M42色譜保留時間相近，根據高分辨精確相對分子質量推測它們的分子式為C17H19O9，且相對分子質量比隱綠原酸多14（CH2）。在它們的ESI-MS2譜圖中，均產生碎片離子為/173 [奎尼酸－H－H2O]?、/137 [二氫咖啡酸－H－CO2]?和/191 [奎尼酸－H]?，故將它們鑒定為隱綠原酸甲基化產物。

M23、M31、M34、M36、M38和M40的理論精確相對分子質量均為/369.118 01，推測它們的分子式為C17H21O9，誤差均小于3×10?6。由于其相對分子質量較M17多14，較M21多2，且在ESI-MS2譜均產生/173 [奎尼酸－H－H2O]?和/191 [奎尼酸－H]?等，推測它們為隱綠原酸氫化和甲基化產物。

M46的準分子離子峰[M－H]?為/543.171 72，推測分子式為C24H31O14，誤差為8.9×10?7。在其ESI-MS2譜圖中，通過丟失176產生碎片離子/367 [M－H－C7H12O5]?，表明其分子中含有葡萄糖醛酸基團。同時，/367比原藥分子式多CH2，結合二級碎片離子/173 [奎寧酸－H2O－H]?和/135 [咖啡酸－CO2－H]?，表明分子存在奎尼酸骨架、咖啡酸骨架。因此，M46被鑒定為甲基隱綠原酸的葡萄糖結合產物。

4 隱綠原酸在大鼠體內的代謝途徑分析

通過分析，本研究共從大鼠的血漿、尿液和糞便中鑒定了47個代謝產物，其中有5個代謝產物通過與對照品的精確相對分子質量、特征碎片離子以及色譜保留行為比對而被準確鑒定。通過歸納分析，隱綠原酸在大鼠體內的主要代謝反應有異構化、氫化、甲基化、葡萄糖醛酸化以及它們的復合反應。其中，本研究并未檢出原藥隱綠原酸，而其同分異構體綠原酸、新綠原酸等均檢出，說明隱綠原酸在大鼠體內穩定性較差，極易發生異構化反應。同時，隱綠原酸在結構上由咖啡酸和奎尼酸脫水縮合形成，當隱綠原酸進入體內后極其容易水解成咖啡酸和奎尼酸2個核心代謝產物，并在此基礎上發生進一步的代謝轉化反應，涉及的反應有葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、去羥基化以及它們的復合反應。其主要代謝途徑見圖1。

圖1 隱綠原酸在大鼠體內的代謝途徑

5 討論

本研究利用UHPLC-Q-TOF MS高分辨質譜聯用技術分析鑒定了隱綠原酸在正常SD大鼠血漿、尿液及糞便中的代謝產物。通過分析這些代謝產物的精確分子質量、質譜裂解規律以及特征碎片離子等，篩選鑒定了47個代謝產物。其發生的主要代謝反應與綠原酸較為相似，主要緣于二者類似的母核結構和取代模式。本研究為進一步研究綠原酸類的體內代謝奠定了基礎。

除此之外，隱綠原酸進入體內后產生核心代謝產物咖啡酸和奎寧酸，并在此基礎上發生進一步的代謝，產生阿魏酸、異阿魏酸、香豆酸等，它們均具有很好的抗菌消炎的藥理作用，上述結果可為隱綠原酸的臨床應用研究以及闡明藥效學物質基礎提供借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Metabolite identification of cryptochlorogenic acid in rats using UHPLC-Q-TOF MS

LI Fang1, LI Jie2, WANG Yu-qi2, DONG Fan1, TAOYu-fan3,WANG Shao-ping3, ZHANG Jia-yu3

1. School of Pharmacy, Fengtai Maternal and Children’s Health Hospital of Beijing, Beijing 100069, China 2. School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 3. School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China

To elucidate themetabolites of cryptochlorogenic acid in rat plasma, urine and feces samples.Urine, plasma and feces samples were collected after oral gavage. After processing biological sample by solid-phase extraction, an efficient method of ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF) mass spectrometer was established to identify its metabolites.According to the obtained accurate mass weight, chromatographic retention behavior, mass spectrometry cleavage, characteristic fragment ions, reference comparison, and related literature reports, a total of 47 metabolites were finally screened and characterized. The main metabolic pathways contained hydrolysis, isomerization, hydrogenation, glucosylation and their complicated reactions.The results showed that the metabolism of cryptochlorogenic acid could be comprehensively clarified by using UHPLC-Q-TOF mass spectrometer. Moreover, our study provided the scientific evidence for the further study of the pharmacological material basis of cryptochlorogenic acid.

cryptochlorogenic acid; rats; UHPLC-Q-TOF MS; metabolite identification; biological samples

R284.1

A

0253 - 2670(2021)13- 3810 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.005

2020-12-20

2017年北京市科技新星與領軍人才培養專項計劃（Z171100001117029）；濱州醫學院高層次人才科研啟動基金項目（2019KYQD05）；山東省青創人才引育創新研究團隊；煙臺市校地融合中藥大健康產業化平臺項目

李 芳（1980—），女，博士，副主任藥師，研究方向為中藥調肝方藥藥理研究。Tel: (010)83917191 E-mail: myhappyflash@126.com

張加余（1981—），男，教授，碩士生導師，主要從事中藥質量控制及體內代謝研究。Tel: (0535)6913719 E-mail: zhangjiayu0615@163.com

[責任編輯 王文倩]