低分子肝素對大鼠COPD 模型肺組織中肝細胞生長因子的影響

吉圣珺 溫業良 張培芳 賴其廷 莫冠文

1佛山市第一人民醫院感染管理科 528000；2佛山市第一人民醫院呼吸內科 528000

COPD 是一種常見的呼吸系統疾病,該疾病發病后以持續的氣流受限為特征,且氣流受限呈現出進行性的發展,具有較高的致殘率、致死率。近年來隨著人們生活方式及環境的改變,該疾病的發病率也呈現出低齡化的趨勢,因此該疾病的治療受到社會各界的廣泛關注[1-2]。在既往的研究中已有學者指出血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor,VEGF）、 肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）在肺組織的損傷、修復中發揮重要作用,前者能作用于血管內皮細胞,促使新生血管生成,而后者則能與肝細胞生長因子受體 （c-metprotoncogene,c-met）結合,具有調節細胞分化、增殖的作用,可促進器官組織的再生及傷口愈合[3-4]。同時也有學者指出COPD繼發肺動脈高壓時使用低分子肝素 （low molecular weight heparin,LMWH）能夠改善患者預后,但臨床上對于其具體的作用機制尚不清楚[5-6]。基于此,本研究建立動物模型,探討COPD形成時VEGF、HGF所產生的作用、機制,以及LMWH 對上述指標所產生的影響,以期為COPD 的治療提供循證依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物選取 實驗性研究。清潔級雄性SD 大鼠30只,購自廣東省醫學實驗動物中心,實驗動物合格證號： 粵監證字 2008A020, 批號：0034927,體質量170～230 g,所有大鼠均按照實驗動物管理和使用指南進行飼養和處理,于恒溫環境中飼養,自由飲水和進食。實驗經佛山市第一人民醫院倫理委員會核實批準 （2016-20 號）,以隨機數字表法將所有大鼠分為對照組、COPD 組、LMWH 組,每組10只。

1.2 大鼠喂養模型建立 對照組大鼠于正常環境下使用國家標準嚙齒類動物飼料進行喂養（中國醫科大學動物實驗部）；COPD 組與LMWH 組通過熏煙及注入脂多糖（美國Sigma公司）建立COPD模型,喂養方式同對照組,于第1天、第14天氣管內注入脂多糖200μg,第2～40天 （不包含第14天）將大鼠放置于有機玻璃箱內 （80 cm×60 cm×50 cm）熏煙,每次點燃20支山東中煙工業生產的將軍牌香煙,持續1 h后間隔4 h再次點燃20支香煙,每日熏煙2次,其中LMWH 組熏煙前0.5 h腹部皮下注射LMWH （輝瑞比利時公司）1 ml,1次/d。

1.3 標本采集及實驗室數據獲取 煙熏結束后3組大鼠經10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后固定、處死,肉眼觀察肺組織,使用HE染色法進行肺組織石蠟切片檢查,判定造模是否成功,結扎右肺后于肺門分離肺組織,經生理鹽水沖洗后取右肺下葉,經10%甲醛固定后行石蠟包埋,制成石蠟切片,另取右肺上葉組織于組織液氮中保存。

1.3.1 肺組織中VEGF、HGF、c-met蛋白水平檢測 應用蛋白免疫印跡法檢測VEGF、HGF、c-met蛋白水平。取液氮中肺組織,提取裂解液、蛋白定量后行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,全濕式電轉膜法轉移至PVDF 膜后溫室封閉1 h,再分別置入兔抗鼠VEGF 多克隆抗體、兔抗鼠HGFα （H-145）多克隆抗體、兔抗鼠c-met（SP260）多克隆抗體、1∶200兔抗鼠β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）,溫室孵育2 h后TBST 緩沖液漂洗3次,5 min/次；經化學發光增強劑反應1 min后于暗室壓入X 光片,曝光后行計算機灰度掃描,通過VEGF、HGF、c-met與β-actin吸光度值的比值獲得VEGF、HGF、c-met蛋白水平。

1.3.2 肺組織中VEGF、HGF、c-met m RNA 水平檢測 應用反轉錄-聚合酶鏈反應 （reverse transcription-polymerase chain reaction, RTPCR）檢測VEGF、HGF、c-met m RNA 水平。取液氮中肺組織,行總RNA 提取后通過一步法行VEGF、HGF、c-met cDNA 逆轉錄及PCR 擴增。VEGF 上游引物：5'-AAACTCTTCCTACCCTCCCC-3', 下游引物：5'-CACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3',片段長度431 bp；r HGF 上游引 物：5'-TTGGGCCAT-GAATTTGACCTC-3',下游引物：5'-ACATCA-GTCTCATTCACAGC-3',片段長度559 bp；c-met上游引物：5'-AAACTCTTCCTACCCTCC-CG-3', 下游引物：5'-AATCTGGCTTGCTTTGTGC-3', 片 段 長 度455 bp；內參照 GAPDH 上游引物：5'-GGCTGAGAATGGGAAGCTGGT-CAT-3', 下游引物：3'-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-5',片段長度142 bp。于50 ℃30 min、95 ℃30 s 62 ℃60 s、72 ℃1 min條件下循環30次,再在72 ℃環境下延伸7 min,行1.5 g/L瓊脂糖電泳后使用Bio-Rad系統分析瓊脂糖凝膠掃描與擴增條帶光密度,以VEGF、HGF、c-met與GAPDH 光密度值的比值獲得VEGF、HGF、c-met m RNA 相對含量。

1.3.3 肺組織轉化生長因子β （transforming growth factor-β1,TGF-β1）水平檢測 取液氮中肺組織,于細胞裂解液中取冰上勻漿,在4℃環境下離心3 000 r/min （離心半徑12 cm）,30 min后取上清,置于96孔板中,以酶聯免疫吸附法檢測TGF-β,大鼠TGF-β酶聯免疫吸附法試劑盒由美國R&D 公司生產。

1.4 觀察指標 比較3 組大鼠肺組織的VEGF、HGF、c-met蛋白水平；比較3 組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met mRNA 水平；比較3組大鼠肺組織TGF-β水平。

1.5 統計學分析 選用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行處理,計量資料以±s表示,先進行方差齊性檢驗；多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met蛋白水平比較 與對照組比較,COPD 組及LMWH 組VEGF吸光度值、HGF 吸光度值、c-met蛋白吸光度值顯著升高,差異均有統計學意義 （P＜0.05）。與COPD 組比較,LMWH 組VEGF 吸光度值、HGF吸光度值、c-met吸光度值顯著降低,差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met蛋白水平比較 （A,±s）

表1 3組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met蛋白水平比較 （A,±s）

注：VEGF為血管內皮生長因子；HGF 為肝細胞生長因子；c-met為肝細胞生長因子受體；與對照組比較,a P ＜0.05；與COPD組比較,b P ＜0.05

組別鼠數VEGF吸光度HGF吸光度c-met吸光度對照組10 0.05±0.01 0.03±0.01 0.47±0.02 COPD 組10 0.11±0.03a 0.08±0.03a 0.61±0.03a LMWH 組10 0.08±0.02ab 0.06±0.02ab 0.51±0.02ab F 值19.286 13.571 91.765 P 值0.000 0.000 0.000

2.2 3 組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met m RNA 水平比較 與對照組比較,COPD 組、LMWH 組VEGF、HGF、c-met mRNA 水平顯著升高,差異均有統計學意義 （P值均＜0.05）。與COPD 組比較,LMWH 組VEGF、HGF、c-met m RNA 水平顯著降低,差異均有統計學意義（P值均＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met m RNA 水平比較 （±s）

表2 3組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met m RNA 水平比較 （±s）

注：VEGF為血管內皮生長因子；HGF 為肝細胞生長因子；c-met為肝細胞生長因子m RNA 水平；與對照組比較,a P ＜0.05；與COPD組比較,b P ＜0.05

組別鼠數VEGF mRNA HGF mRNA c-met mRNA對照組10 6.84±0.88 4.21±1.30 0.70±0.18 COPD 組10 11.05±1.42a 8.89±2.57a 1.21±0.34a LMWH 組10 8.02±0.95ab 7.01±1.54ab 0.98±0.22ab F 值38.309 15.684 9.964 P 值0.000 0.000 0.001

2.3 3組大鼠肺組織TGF-β水平比較 與對照組比較,COPD 組、LMWH 組TGF-β 水平顯著升高,差異均有統計學意義 （P值均＜0.05）。與COPD 組比較,LMWH 組TGF-β水平顯著降低,差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3組大鼠肺組織TGF-β水平比較 （ng/g,±s）

表3 3組大鼠肺組織TGF-β水平比較 （ng/g,±s）

注：TGF-β為轉化生長因子β；與對照組比較,a P ＜0.05；與COPD組比較,b P ＜0.05

組別鼠數TGF-β對照組10 136.42±18.44 COPD組10 342.15±31.09a LMWH 組10 204.12±22.18ab F 值183.369 P 值0.000

3 討論

COPD 的致病原因臨床上分為內、外兩大因素,前者包括遺傳、氣道反應性增高及其他因素導致的肺部生長或發育不良,后者常見有呼吸道感染、空氣污染、吸煙等,發病后往往會形成呼吸困難、胸悶、喘息等癥狀,在流行病學調查中有學者指出國內現有COPD 患者4 000萬,年致殘人數達500萬～1 000萬,病死100 萬,對患者的健康及生命安全帶來了嚴重的威脅,因此對COPD 的治療一直是臨床研究的熱議課題之一[7-8]。抗栓干預是COPD 治療方式之一,其中LMWH 較為常用,能夠緩解患者臨床癥狀,抑制肺動脈高壓,在改善患者預后中表現出了較好的效果,然而其具體的作用機制仍有待探討。為此本研究建立COPD 大鼠模型,探討LMWH 對COPD 大鼠肺組織VEGF、HGF的影響,旨在為該疾病的治療提供理論指導。

本研究結果顯示,3 組大鼠肺組織VEGF、HGF、c-met蛋白水平以及VEGF、HGF、c-met m RNA 水平比較差異均有統計學意義,表現為COPD 發病時VEGF、HGF、c-met均明顯上升,可能與COPD 發生、發展有關,而LMWH 則能夠抑制其水平表達。郝敏等[9]在COPD 動物模型中認為LMWH 能夠抑制大鼠的VEGF 表達,同時郝翠萍等[10]也在大鼠肺組織VEGF、HGF 水平觀察中指出COPD 大鼠肺組織中VEGF、HGF 呈現出明顯的增高,與本研究各指標變化基本相符。

COPD 的病理基礎表現為肺組織的損傷-修復過程,其中HGF 是肺組織損傷-修復中的重要指標,對腎、肺臟及其他組織均有再生效應,同時HGF還能作用于多個器官的內皮及上皮細胞,發揮局部炎癥的抑制效果,同時c-met為HGF受體,其水平表達可能是HGF的高表達導致c-met異常激活,故其水平明顯上升[11-12]；而VEGF 則廣泛存在于人及動物體內,在炎癥刺激及氧化應激的作用下VEGF 可出現代償性的增高,由此可見VEGF、HGF能夠參與到COPD 的發病,而其水平的上升可能促進疾病的進展[13-14]。LMWH 具有抗凝、抗炎作用,能夠降低高凝狀態,減輕炎癥反應,可對COPD 引起的氧化應激起到保護作用,LMWH 組VEGF、HGF、c-met水平的降低可能與此有關[15]。

本研究結果顯示,3 組肺組織中的TGF-β水平,COPD 組最高,提示COPD 中TGF-β存在異常高表達。有研究顯示TGF-β能夠減少血管內皮細胞與HGF的生成,降低血管局部HGF 對肺血管內皮細胞的保護作用[16],因此其水平增高可能是COPD 發病的危險因素之一,至于LMWH 組TGF-β水平顯著降低,考慮可能與LMWH 抑制TGF-β1 啟動子與調節性AP-1 位點結合,從而抑制TGF-β表達有關,但仍需后續研究。同時在既往動物實驗中已有學者指出LMWH 可抑制TGF-β水平表達[17]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突