柳葉蠟梅真菌病害分離鑒定及生物學特性

彭成彬，王澤榕，阮俊峰,3，魏日鳳，薛 嵐，陳美霞,3 ，劉 偉,3

（1. 寧德師范學院生命科學學院，福建 寧德 352100；2. 福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；3. 福建省產學研合作示范基地，福建 寧德 352100；4. 寧德師范學院化學與材料學院，福建 寧德 352100）

0 引言

【研究意義】柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifoliusS. Y. Hu）是我國特有的樹種，屬于樟目蠟梅科蠟梅屬的木蘭類植物，多年生半常綠灌木，在森林群落生態系統中屬于優勢灌木樹種[1]。柳葉蠟梅生長于福建省壽寧縣、安徽省黃山市、江西省修水縣、浙江省麗水市等地的山區[2]。柳葉蠟梅花期較長，在南方地區常作為庭院綠化和園林觀賞植物。柳葉蠟梅葉片作為畬族民間常用的藥材之一，揉碎即芳香，含有多種生物活性成分（揮發油類、倍半萜類、黃酮類、香豆素、蒽醌與生物堿類等），具有抗氧化、消炎、增強免疫調節等藥理作用[1,3]。人們對柳葉蠟梅的需求量不斷增加，造成對野生資源的無節制采摘，現有的野生資源已近枯竭。近年來，人工引種栽培種植數量提升，但是田間種植管理不到位，關于柳葉臘梅病害報道甚少，尚缺乏對柳葉臘梅病害的深入系統研究。柳葉臘梅真菌病害多發生在葉片上，產生病斑葉片，不能作為加工原料使用，造成產量減少和經濟損失，該病害的發生發展沒有引起足夠的重視，對于綠色防控柳葉臘梅報道甚少，針對引起柳葉臘梅葉部病害的病原菌尚未見報道，生產上迫切需要明確引起其致病的病原菌株才能采取有效針對性措施去防控病害。【前人研究進展】由真菌引起的植物葉斑病的病原菌種類繁多，如煙草莖點霉葉斑病[4]、龍牙百合葉尖干枯病[5]、非洲楝擬莖點霉葉斑病[6]、苜蓿匍柄霉葉斑病[7]等，明確病原菌種類顯得尤為重要，但種與亞種之間的差異越來越小，僅靠形態學鑒定菌株是不準確的，同時分析菌株基因型和表現型，鑒定快速、結果準確。已有研究者利用核糖體DNA非轉錄區（18sRNA、28sRNA、5.8sRNA）的基因序列開發ITS（Internal Transcribed Spacer）標記和β-微管蛋白由β-tubulin基因所編碼基因序列開發成β-tubulin標記，二者的序列相識度較高且生物進化具有高度保守基因片段，這二種標記已被諸多研究者用于菌類鑒定[8－10]。【研究的切入點】對于侵染柳葉臘梅的病原菌種類尚待進一步研究。【擬解決問題】本研究結合傳統的鑒定方法和分子方法ITS序列、β-tub序列對柳葉臘梅的病原菌進行分離鑒定，并對其生物學特性進行了初步研究，以明確其病原菌種類，探究其生物學特性，以期為柳葉臘梅葉斑病的綜合防治、抗性種質資源篩選 和抗病品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試致病菌分離自柳葉蠟梅葉部病斑，采集自寧德壽寧縣福瑞泰生物技術有限責任公司的種植基地 。經室內無菌條件下分離純化得到供試菌株1013-1。

1.2 供試試劑

供試3種培養基，包括PDA瓊脂培養基，PD液體培養基，OA培養基和查氏瓊脂培養基（Czapek Agar）。上述培養基參照文獻[11]配置，置于115 ℃高 壓滅菌20 min 后備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 柳葉臘梅病斑致病菌分離純化 參照植病研究方法[11]，采用常規組織分離法進行柳葉臘梅葉斑病病原菌的分離純化，分離純化5代后，即得到病原 菌菌株。

1.3.2 致病性鑒定 將分離自柳葉臘梅病原菌株分別接種至PDA 平板上，置于培養 5 d后，用無菌的5 mm 的打孔器分別打取菌餅和空白瓊脂平板分別接入進行離體柳葉臘梅葉片回接侵染。26 ℃保濕培養，逐日觀察葉片的發病情況，若發病，則對柳葉臘梅葉片發病部位再重新組織分離，得到與原始接種菌株真菌形態一致的菌株，則可確定為該病的病原 菌。

1.3.3 致病菌形態學鑒定 接種純化的1013-1菌株至PDA 培養基和OA培養及中央，28 ℃黑暗條件下培養，定期觀察記錄菌落培養特征，在培養5 d的菌落邊緣滴加適量1 mol·L－1的 NaOH溶液，在10 min和2 h后觀察并記錄培養基的顏色變化。通過顯微鏡觀察分生孢子形態特征并拍照保存。根據菌落形態特 征和分生孢子特征確定病原菌種類。

1.3.4 分子鑒定 1013-1病原菌基因組DNA按照試劑盒提取的方法進行（天根生化科技有限公司，北京），分別擴增 rDNA-ITS 序列和微管蛋白延伸因子（β-Tub）片段。2對引物序列分別為ITS1（5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGC-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）和β-Tubf（5′-GACCCTTGGC CCAGTTGTTTCCAG-3′）/β-Tubr（5′-CAGAAAGCA GCACCGTTTTTGGTT-3′），引物合成委托福州鉑尚生物技術有限公司完成。PCR反應體系擴增程序見表1，分別取5 μL上述PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，15 min），檢測ITS和β-Tub的PCR 產物片段大小，符合結果的PCR 擴增產物送到福州鉑尚生物技術有限公司委托進行測序。所測序列結果提交到NCBI的GenBank進行BLAST搜索比對，采用軟件 MEGA 5.0 的Neighbour-Joining法（簡稱：N J）構建ITS和Tub聯合序列的系統發育樹分析。

表1 ITS和β-Tub PCR擴增反應程序Table 1 Primer ITS and β-Tub PCR amplification procedures

1.3.5 溫度對菌絲生長的影響 用無菌的5 mm直徑打孔器打取培養5 d的1013-1菌落邊緣菌餅備用，分別將菌餅接種置于 PDA培養基中央（皿的直徑為9 cm，下同），分別置于5～40 ℃條件下（每5 ℃為一個梯度，共8個不同溫度條件）恒溫培養，7 d后用十字交叉法分別測定1013-1病原菌的菌落直徑 。每處理重復3次。

1.3.6 pH對菌絲生長的影響 用0.1 mol·L－1HCl和0.1 mol·L－1NaOH調配pH 3～12的PDA培養基。滅菌后接入5 mm菌餅，菌餅獲取方法同1.3.5，置于28 ℃恒溫培養，7 d后用十字交叉法測定1013-1病原 菌的菌落直徑。每處理重復3次。

1.3.7 光照對菌絲生長的影響 用滅菌后PDA培養基，接入5 mm菌餅菌餅，獲取方法同1.3.5，分別置于連續光照、12 h光照12 h黑暗交替、完全黑暗3種光照條件下，28 ℃恒溫培養，7 d后用十字交叉法 測定1013-1病原菌的菌落直徑，每處理3次重復。

1.3.8 不同碳源對菌絲生長的影響 以查式培養基為基礎培養基，將其中的蔗糖以葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、山梨醇、肌醇、木糖醇等量替換，即成含糖量相同而碳源不同的培養基，滅菌后接入5 mm菌餅，菌餅獲取方法同1.3.5，置于28 ℃恒溫培養，7 d后用十字交叉法測定1013-1病原菌的菌落直徑，每處理3 次重復。

1.3.9 不同氮源對菌絲生長的影響 以查式培養基為基礎培養基，將其中的硝酸鈉以硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉、尿素、氯化氨、甘氨酸和硫酸銨等量替換，即成含氮量相同而氮源不同的培養基，滅菌后接入5 mm菌餅，菌餅獲取方法同1.3.5，28 ℃恒溫培養，7 d后用十字交叉法測定1013-1病原 菌的菌落直徑，每處理3次重復。

1.3.10 菌絲體的致死溫度測定 將5 mm菌餅置于5 mL無菌試管中，加入 2 mL 滅菌ddH2O。分別在40 、45 、50 、55 、60 ℃水浴鍋中處理10 min 后，將試管內菌絲塊置于 PDA 培養基中央，置于28 ℃下 培養，5 d 后觀察其生長情況。每處理重復 3次，1.3.11 數據統計與分析 數據統計與分析采用 SPSS 17.0軟件對菌落直徑數據進行統計分析處理，并利用 Duncan氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 柳葉臘梅田間病斑和致病性測定

田間柳葉臘梅的葉片發病癥狀：表現為褐色病斑，略凹陷，葉正、背面均可受害。多呈圓形或不規則形，病斑部位有黑色顆粒，病健界限明顯呈現黑褐色，發病后期葉片脫落，田間采集病葉見圖1-a。采用常規組織法分離得到1株致病分離物，編號為1013-1，分別取5 mm純化后的菌餅和空白瓊脂塊，分別接種離體柳葉臘梅葉片，對照組不發病見圖1-b，4 d開始發病，形成褐化病健界限明顯，結果見圖1- c。重 新分離純化可得到相同的病原菌，進行后續試驗。

2.2 形態特征觀察

1013-1分離物在PDA培養基上培養7 d的菌落形態特征見圖1-d和圖1-e。正面菌落棕色相間，邊緣白，前期菌落中部凸起，后期菌落展開扁平，氣生菌絲發達，棉絮狀、絨毛狀，非常致密，邊緣整齊，前期白色，后期出現不同層次的棕色環帶。背面和棕色且深淺顏色交替，呈現同心輪紋狀。孢子見圖1-f，形體呈現多數為梨形和橢圓形，單孢，或者多具 2個油球，1.8～5.4（4.1）×1.5～2.2（2）μm，其分生孢子器見圖1-i，不規則形，末端于菌絲相連。1013-1接種于OA培養基5 d后的菌落，使用1 mol·L－1的 NaOH溶液處理，10 min后見圖1-g，菌落邊緣呈現墨綠色，2 h后見圖1-h，菌落邊緣呈現棕色，綜合 上述結果，結合文獻資料初步判斷為高粱附球菌[12]。

圖1 菌落形態和致病性鑒定Fig. 1 Colony morphology and pathogenic assay

2.3 PCR克隆及測序分析序列分析

分別提取病原菌株的基因組DNA進行特異性引物ITS和β-tub擴增1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V電壓下15～20 min），結果（圖2）可知擴增的ITS和β-tub條帶單一、清晰明亮、分子量分別在500～750 bp和250～500 bp，與預期大小一致。測序分析結果經NCBI比對，下載同種屬序列[13]，序列同源性分析和進化樹結果見圖3，1013-1菌株的ITS序列與登錄號MN493119為Epicoccum sorghinum相似度達100%，β-tub序列與登錄號MN512426為Epicoccum sorghinum相似度達100%，綜合形態學結果和分子鑒定結果，得 出該病原菌為高粱附球菌E. sorghinum。

圖2 PCR結果Fig. 2 Result of PCR

圖3 基于ITS+TUB序列聯合分析構建NJ-系統樹Fig. 3 NJ-system tree derived from ITS and β-Tub sequence analysis

2.4 不同條件下菌絲生長影響

2.4.2 pH對菌絲生長的影響 培養7 d后測量菌落直徑，由表2可知，1013-1病原菌在pH 3～11下均可生長，適宜生長范圍是 pH 值為5～9時，菌絲生長較好，菌絲直徑達到最大值8 cm。病原菌在弱酸到中性到弱堿環境下有利菌絲生長，酸性或堿性過強 都會抑制病菌的生長。

表2 不同溫度和pH處理病原菌的菌落直徑Table 2 Diameters of pathogen colonies at different temperatures and pHs

2.4.3 光照對菌絲生長的影響 培養7 d后測量菌落直徑，由表3可知，病原菌在連續光照、12 h光照12 h黑暗交替、完全黑暗，這3種光照條件下均可生長，三者菌絲直徑差別不顯著。光照處理對菌絲生 長影響不大。

表3 光照對生長影響Table 3 Effect of light on mycelial growth

2.4.4 不同碳源對菌絲生長的影響 在碳源測定中，培養7 d的結果從表4可知，病原菌在不同碳源上均能生長，在供試的11種碳源中，該菌在以蔗糖和麥芽糖為碳源的培養基中生長最快，其菌落直徑最大，為 8 cm，極顯著高于其余碳源，其次為葡萄糖，病原菌以蔗糖和麥芽糖為最佳碳源。在以可溶性淀粉為碳源的培養基，其菌落直徑最小，為6.02 cm，菌 絲生長較慢。

2.4.5 不同氮源對菌絲生長的影響 在氮源測定中，培養7 d的結果從表4可知，氮源對病原菌生長（菌落直徑）的影響不顯著，在供試的8種氮源中，其中，硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉和甘氨酸的菌落直徑均為8 cm，以氯化氨為氮源的培養基其菌絲生長慢，菌落直徑為4.25 cm，對氯化氨利用 率低，尿素作為氮源不適合1013-1病原菌生長。

表4 病原菌在不同碳源和氮源處理下的菌落直徑Table 4 Diameters of pathogen colonies on media of different carbon and nitrogen sources

2.4.6 菌絲體的致死溫度測定 5 mm菌塊在40～50 ℃的水浴溫度處理后，病原菌1013-1仍然能在 PDA 培養基上生長，55～60 ℃，病原菌1013-1在PDA培養基上不再生長，菌餅在51 ℃的水浴溫度處理后能在PDA培養基生長，而菌餅在52～54 ℃的水浴溫度處理后，病原菌1013-1不再生長，表明病原菌1013-1致 死溫度為52 ℃。

3 討論

近年來，由于柳葉臘梅的葉片價值最高，諸多研究多集中于葉片成分藥用價值開發上，國內外對其病害防控研究報道甚少。柳葉臘梅病害發生，形成病斑占據葉片面積，引起植物防御反應，葉片自身程序性凋謝脫落，影響樹勢生長，進而導致產量減少，帶來經濟效益損失。本研究分離柳葉臘梅葉斑病所得的病原菌株為高粱附球菌（E. sorghinum），研究表明，E. sorghinum最早是在高粱葉片上分離得到[14]，后面陸續在玉米[15]、百合[5]、燕麥[16]被發現。該病原菌是一個較有爭議的病原菌，既能作為致病菌侵染植物，同時又能作為內生菌存在，分泌的代謝產物之一細交鏈孢菌酮酸是一種天然毒素，被列為食品安全檢測作為重點監測對象[17]，分泌的另一種代謝產物是新型蒽醌衍生物，具有殺菌、除草及抗腫瘤的作用[13,15,18]。E. sorghinum很有應用開發價值，已有報道以內生菌用于抑菌實驗[19]。而本研究對E. sorghinum的理化性質和分泌代謝物方面的研究少，我們在后續將嘗試引入多種植物病原真菌進行拮抗實驗驗證，嘗試開發E. sorghinum相關代謝物質作為抑菌劑的應用。在對E. sorghinum的生物學特性進行探究的過程中我們發現，受玻璃培養皿的大小限制影響，在氮源上硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉和甘氨酸的菌落直徑均為8 cm，但是發現第3～5 d菌落培養情況和菌落直徑記錄發現蛋白胨的菌落直徑均優于其他氮源，研究結果綜合考慮蛋白胨是該菌的最適氮源，本研究的生物學特性結果與LIU研究的E. nigrum的溫度和氮源結果一致，但是在pH和碳源都存在略微的差異，LIU等[20]研究表明最適碳源是麥芽糖和葡萄糖，pH適宜范圍在6 ～9，而本研究最適碳源是麥芽糖和蔗糖，pH適宜的范圍在5～9，推測可能是由于不同種之間會存在差異所致，還有待深入研究。柳葉臘梅其活性成分在長期自然進化過程形成的，這些物質對人類有益，對于天敵而言卻是致命，而E. sorghinum在長期侵染柳葉臘梅葉片中是否也發生協同進化如細胞壁加厚，細胞液泡濃度增高等還有待后續深入研究。

4 結論

柳葉蠟病害防治研究方面相對空缺，本研究首次報道了壽寧縣柳葉臘梅的一種新病害，葉斑病病原菌經形態特征觀測和rDNA-ITS和TUB序列在NCBI數據庫的分析比對，鑒定為子囊菌門，格孢腔目，附球真菌屬，高粱附球菌E. sorghinum。該病原菌的最適生長溫度為25 ℃，最適pH值范圍為5～9，最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨（綜合第5 d的培養菌落直徑），光照對該菌株的生長沒有影響，菌絲體致死溫度為 52 ℃。本研究為柳葉臘梅葉斑病的綜合防治、抗性種質資源篩選和抗病品種選育提供理論參考。