甲型流感病毒血凝素研究進展

蘭 旭，鄧春青

甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)是一種有囊膜、分節段的單股負鏈RNA病毒，可使人、禽、豬、犬、馬和水貂等在內的許多物種致病。根據血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase,NA)的差異可分為不同的亞型，現已發現18種 HA (H1～H18)和11種 NA (N1～N11)[1]。物種不同，流行的亞型不同。單就HA而言，禽中幾乎可以找到HA的所有類型(存在于蝙蝠中的H17和H18除外[1])；豬中主要流行H1、H2、H3[2]，同時也可見H4[2]、H6[3]和H9[4](局限于中國)等亞型；馬中主要流行H3和 H7等亞型[2]，H9[4]已出現；犬中以H3亞型為主，H1、H5、H6、H9和H10等亞型也已出現[3,5]；而海洋哺乳動物曾分離到H1、H3、H4、H7、H10等亞型[2]。我國流行性感冒監測數據顯示，目前感染人的甲型流感病毒主要為H1和H3亞型[6]。歷史上只有H1、H2和H3亞型與人類大流行有關，但H4～H7、H9～H11亞型已跨越物種屏障引起零星感染，其跨物種機制仍有待進一步研究[4,7-8]。值得注意的是，H3亞型現已在大多數物種中出現并逐漸流行，其宿主范圍最廣。由此可見，HA蛋白與病毒的宿主嗜性高度相關，這也是HA蛋白備受關注的原因之一。另外，HA蛋白作用于流感病毒生命周期的啟始，決定著病毒感染能否成功開啟，對病毒本身意義重大。自1952年流感成為第一個實行全球監測的傳染病起[9]，流感病毒HA蛋白的監測一直是該領域的研究熱點。隨著人們對HA蛋白認識的不斷加深，抑制血凝素的藥物也一直在推陳出新。

1 形態結構

HA蛋白是由基因組第4節段編碼的一種同源三聚體抗原蛋白，具有Ⅰ型跨膜糖蛋白結構，其晶體結構于1981年被Wilson IA等[10]所解析。在外觀形態上，HA蛋白可分為球形頭部和桿狀莖部。頭部主要由HA1肽鏈組成，內含受體結合位點(Receptor binding site, RBS)和抗原位點(Antigenic site)。近年來，Zhu X等[11]認為，近乎所有的HA(包括H17)具有相似的RBS：呈淺桶狀，邊緣由HA1 155和3個HA1結構元素(190螺旋、130環和220環)圍繞而成，底部由一些保守的芳香族殘基(Y98，W153，H183和Y195等)構成。莖部靠近病毒囊膜，由HA1肽鏈的N、C末端及HA2肽鏈螺旋纏繞而成[12]。HA2蛋白C末端內含疏水序列和棕櫚酸連接的質膜定位序列，N末端內含融合肽(Fusionpeptide，FP)[13]。RBS介導病毒與受體[唾液酸(sialic acid, SA)]特異性結合，通常人類流感病毒的RBS與SAα2, 6Gal結合，而禽流感病毒則與SAα2,3Gal結合；抗原位點可以刺激機體產生抗體；而FP則與膜融合相關。

2 功能作用

過去的研究表明，流感病毒的RBS與SA特異性結合，隨后病毒粒子將通過網格蛋白和非網格蛋白介導的內吞作用或大吞噬作用，以內體(Endosome)的形式進入宿主細胞，內體中逐漸降低的pH值和逐漸升高的K+等信號將促進病毒的膜融合與脫殼[14-15]。最近有學者提出，RBS與SA的多價連接以及NA對該連接的水解作用(即HA-NA-SA三者間的平衡)將實現病毒粒子的運動游走，最終使其到達指定地點并成功吸附[16]；而甲型流感病毒NA蛋白的第二唾液酸結合位點則是HA-NA-SA平衡的重要決定因素[17]。另外，通過平衡HA-NA功能可以提升病毒粒子的復制功能，從而產生高增長的病毒毒株H7N9 CVV[18]。Wang Z等[19]也發現，HA1中某一氨基酸替換(G225E)將導致病毒復制更快，隨后證明這與它們的組裝和出芽效率不同相關。HA蛋白的功能作用已不再局限于病毒生命周期的“起始”，病毒生命周期的其他階段，例如：復制、組裝、出芽、釋放和游走等也與其相關。當然，隨著對HA蛋白認識的不斷加深，一些未知功能仍有待進一步探索。

3 變異進化

由于宿主內環境的選擇壓力和病毒自身特性等因素的影響，HA蛋白遺傳信息容易發生改變。個別點突變導致的抗原漂移，可引起流感的季節性流行，并決定著每年流感疫苗的組成成分。而點突變的積聚導致的抗原轉變，則可能促進下一波流感大暴發。無論是流感病毒從一個宿主物種到另一個宿主物種的適應，還是其免疫逃逸的產生，甚至是關于平衡功能尚不穩定的HA-NA等，都與HA蛋白的變異進化密不可分。

3.1 單一位點的變異 一般而言，HA蛋白的點突變多發生在抗原位點及其附近和RBS邊緣的殘基上。對于那些能夠穩定保持著的替換趨勢，可能指示著病毒中的某些特定功能；而那些共有且保守的位點，則可被視作抗流感藥物研發的作用靶標。HA蛋白的氨基酸位點變異具有多樣性。此外，病毒的亞型不同，相應的位點變異存在差異。部分功能較為明確的氨基酸位點變異情況見表1。

表1 部分功能明確的HA蛋白氨基酸突變位點Tab.1 Partial functional mutations at amino acid sites in HA protein

在H1亞型中，D127E、S162T等替換可影響病毒的糖基化[24]；E190D[21]、D222G[24]、G225D[21]、R226Q[32]等替換是禽流感病毒為適應人宿主而發生的適應性改變(H3編號)；D222G[24]、D225G[30]等可使病毒具有雙重受體特異性(H3編號)；T200A[32]、D222G(H3編號)[24]、D222N(H3編號)[7,24]、G225E(H3編號)[19]、E227A[33]等可增加病毒的致死率。李敏紅等[34]曾指出，存在D222G或D222N替換容易導致重癥(H3編號)。

在H3亞型中，D81N[21]可影響糖基化；Y98F[11]降低受體結合力，但可能增加其游走性；N121K[25]、T135K[25]、H156Q[35]等與免疫相關；而W222R(H3編號)[29]可影響病毒的感染力。另外，有學者曾指出[21]，為適應人宿主，禽流感病毒的HA蛋白發生了R62I、D81N、N92K、A144G、N193S、Q226L、G228S等替換(H3編號)。

在H5亞型中，126缺失[4]、T160A(H3編號)[7]等影響糖基化；K58I(H7編號)[20]、H103Y[20]、T315I[20]等替換可改變HA蛋白的穩定性；A138S[21]、T160A[7]、E186D[26-27]、Q222L[27]、G224S[27]、Q226L[21]、N227S/R[7]、G228S[21]等為為適應人宿主而發生的適應性改變(H3編號)；K58I(H7編號)[20]可產生雙重受體特異性。

在H6亞型中，I55V[3]、L111F[3]、P186L[3]、A222V[29]、G228S[3]等替換為為適應人宿主而發生的適應性改變(H3編號)；S137N[3]、E190G[3]、A222V[29]等產生雙重受體特異性(H3編號)。

在H7亞型中，K58I[20]、N94K[20]、A151T[23]、G219S[20](相當于H3編碼中的第228位)、I/L226Q(H3編號)[20,31]影響HA蛋白的穩定性；E186D(H3編號)[26-27]、G186V(H3編號)[21]、G219S[20]、Q226I/L(H3編號)[20,31]、I368V[21]等替換為為適應人宿主而發生的適應性改變；G219S[20]、I/L226Q(H3編號)[20,31]等產生雙重受體特異性；A125T[23]、A151T[23]可降低受體親和力；G218E[18]可增加病毒的復制能力。Chang P等[22]分析表明，A125T、A151T和L217Q(相當于H3編碼中的第226位)與免疫相關。另外，A143V(相當于H3編號中的第135位)、R148K與病毒的傳播有關[31]，具體機制有待進一步研究。

在H9亞型中，I155T[4]、H183N[4]、A/I190T/V/D/E[4,28]和Q226L[4]等替換為為適應人宿主而發生的適應性改變(H3編號)；而G72E、G73K、S127N、S132A、D135G、N183D、A180V(相當于H3編號中的第190位)、L216Q(相當于H3編號中的第226位)、N221D、N238D和V239I等替換將使A/H9N2轉變為逃逸突變體[36]。

值得一提的是，Q226L和G228S(H3編號)作為病毒嗜性向哺乳動物方向轉移的標志性替換，在眾多亞型的HA蛋白上都曾出現過，目前前者涉及H2、H3、H5、H7和H9等亞型，后者涉及H2、H3、H5和H7等亞型[21]。這或許與其特殊的位置有關(H3亞型中，兩者既落在HA的抗原表位D上，又落在其RBS的220環內)。何軍等[37]發現，安徽省2013-2018年分離的外環境禽源A/H9N2的HAs在183、189、190、226和227等多個位點均發生突變，這些突變的累積效應使其逐漸向適應哺乳動物方向進化(H3編號)。結合表1及近期相關文獻資料我們認為，在進化過程中相較于153、194、195等位點，135、186、190、222、225、226、227、228等位點相對容易發生突變(H3編號)，且對宿主嗜性影響較為顯著。另外不難發現，RBS的220環上存在較多的易突變位點，而且部分突變還與雙重受體特異性的產生相關；Peacock等[38]也曾指出，220環氨基酸缺失的流感病毒(特別是在H5、H7或H9亞型中)與其他毒株相比可能構成更高的人獸共患病風險，故應警惕。

3.2 變異間的聯系發展 一些研究表明，HA蛋白內不同位點間的替換是具有相關性的。當Q226L與G228S突變共存時，HA蛋白對SAα2, 6Gal的結合明顯增加[39]。N224K和Q226L突變協同可改變受體結合偏好，產生空氣傳播的H5，但這可能還與HA上N158D和T318I替換相關[40]；Wang Z等[19]進一步研究發現HA-N224K/Q226L/T318I突變可使含有來自pH1N1/09病毒7個基因和來自H5N1病毒HA基因的重組病毒獲取在雪貂之間傳播的能力。另外，A/H7N9 HA上的A125T、A151T和L217Q突變可以在傳代培養中同步保持[22]；在進一步的研究中Chang P等發現，A125T+A151T突變可完全消除病毒對SAα2, 6Gal的結合[23]。

各病毒蛋白間的位點變異同樣具有內在聯系。PB1中的H99Y、HA中的H110Y和T160A被認為對病毒在雪貂中的呼吸道傳播是必不可少的(H3編號)[40]；PB2-701N和HA-260M影響著病毒嗜性向哺乳動物方向轉變(H3編碼)[2]。當與適當的NA一起考慮時，HA的第180位殘基(H9編號，相當于H3編號的第190位)是一個很好的哺乳動物適應的分子標志物[28]。在人源A/H9N2分離株中，HA(183N、190T/V、227Q)、PB2(588V、627K/V、701N)和PA(356R、409N)具有關聯性，且是關鍵的哺乳動物適應標記(H3編號)[4]。最近還有研究顯示[41]，甲型流感病毒NA蛋白的第二唾液酸結合位點突變驅動血凝素補償性突變，可能增加人獸共患的潛力。故HA位點的變異不僅在蛋白內部具有協調性，而且其還與NA、PA、PB1和PB2等蛋白的變異相關，進而共同影響著病毒的生物學特性。

4 藥 物

血凝素主要參與病毒生命周期的吸附與膜融合。對于其藥物的研究，在認識的早期階段，研究者們常把目光投注于HA的球形頭部，通過影響RBS及抗原位點來抑制血凝素的功能。現今，研究者們發現，相較于HA球形頭部，莖區的某些序列和結構是高度保守的，尤其是內含的融合肽(HA蛋白中最保守的區域)，這使得它成為一個全新的有吸引力的靶點。目前，許多抑制血凝素藥物的研究較前有所進展，而作用對象大多都集中在HA莖區這一功能區域，例如：一些廣泛性中和抗體及大部分膜融合抑制劑等。

4.1 中和抗體 MEDI8852由MedImmune研發，靶向HA莖區，通過互補決定區(complementarity-determining regions,CDR)協調運動，結合至莖區高度保守的表位(涵蓋融合結構域中的疏水槽和大部分融合肽)，從而抑制HA介導的膜融合過程，也可與HA前體結合來阻斷HA0的裂解[43-44]。對所有IAV均有抑制作用，已進入Ⅱ期臨床開發[45]。

MHAA4549A由Genentech研發，通過結合HA莖區上某些高度保守的表位來阻止融合肽的展開，進而阻斷膜融合，同時促進依賴抗體的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和依賴抗體的細胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)，最終實現抗病毒作用[43,46]。可以中和所有已知的人類甲型流感病毒毒株，在Ⅱa期研究中確定了預計的人體有效劑量(45 mg/kg)[47]。

CR6261和CR8020由Crucell[43]研發，同樣靶向HA莖區。在系統遺傳進化方面，HA分為2個進化組：組1(包含H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18)和組2(包含H3、H4、H7、H10、H14、H15)[48]。CR-6261[49-50]識別HA1/HA2膜近側莖中高度保守的螺旋區，主要與HA2-A螺旋相互作用，但也與HA1-N端的部分殘基接觸；其可能通過穩定融合前狀態來阻斷與膜融合相關的構象重排而發揮抗病毒作用；作用于第1組，目前已進入Ⅲ期臨床研究。而CR-8020作用的表位殘基則位于融合肽的關鍵區域(HA 21-25)和HA2的螺旋帽狀區(H3編號)，其通過分離融合肽并阻止其在低pH下的釋放來阻止融合，同時還可能通過抑制宿主蛋白酶裂解HA0來干擾融合[51]；對第2組的HA有抑制作用，也已進入臨床試驗階段[50]。兩者互為補充，聯合治療可拓寬對宿主的保護范圍。

VIS410由Vistera研發，靶向HA莖區，主要作用于其上一高度保守的A螺旋區域，通過與HA的莖區結合從而阻止膜融合過程來終止病毒復制周期，在體外試驗中還表現出ADCC作用[52]。可廣泛中和流感病毒第1組的H1、H2、H5、H6、H9和第2組的H3、H7等亞型，已進入Ⅱ期臨床研究[50,52-53]。另外有報道顯示[54]，在GISAID數據庫中，0.06%的HA序列中已鑒定出對VIS410體外敏感性降低的變異體(HA2 N53D)。

有待進一步研發的抗體(靶向部位)還包括：CH65(RBS)、C05(RBS)、5J8(RBS)、F045-092(頭部)、27F3(莖區)、CR9114(莖區)、FI6v3(莖區)、F10(莖區)、PN-SIA28(莖區)、CT-P27(莖區)等。

4.2 受體結合抑制劑 DAS181(Fludase)[45]是一種重組的唾液酸酶融合蛋白,通過除去宿主細胞表面的唾液酸，來抑制HA蛋白的吸附過程。其對季節性甲、乙型流感病毒有抑制作用，對小鼠H5N1病毒感染有防治作用，對耐奧司他韋的H1N1臨床分離株也有效，目前處于Ⅲ期臨床研究[55]。此外，還有Cyanovirin-N、FluPep等有待進一步研發。

4.3 膜融合抑制劑 阿比朵爾是一種吲哚類化合物，通過穩定HA的結構來阻斷HA介導的融合過程，對甲型、乙型流感病毒毒株都具有抑制作用[47]。目前，美國正在進行Ⅳ期臨床研究，我國已上市[56]。硝唑尼特(nitazoxanide，NT-300)是一種噻嗪類廣譜抗病毒藥物，在體內轉化為活性形式—替唑尼特 (tizoxanide)，作用于翻譯后階段，通過阻斷HA糖基化等影響HA成熟、干擾HA0的胞內轉運[45]。其對多種人和禽流感病毒(H1N1、H3N2、H5N9、H7N1等)均有活性，目前處于Ⅲ期臨床試驗階段[50,57]。 其他噻唑類化合物還包括：RM-5014，唑沙尼特，RM-5038等[50]。同時，TBHQ、苯磺酰胺類化合物(RO5464466和RO5487624)、MBX2546和MBX2329、CBS1117和H84T等目前也在研發中。

4.4 天然小分子物質 大自然中還存在一些對血凝素有抑制作用的天然小分子物質，例如：赤芍、白芍、金縷梅及牡丹皮等中的鞣質化合物(五沒食子酰基葡萄糖、單寧酸等)[58]、接骨木莓和金蕎麥等中的黃酮類化合物(甲基槲皮素和二氫楊梅素等)[59-60]、姜黃中的多酚化合物(姜黃素)[61]、穿心蓮內酯磺化物[62]、板藍根水提物S-03[63]、PPa[64]、urumin[65]、EGCG[66]、spiromastilactones[50]、Stachyflin[55]、OA-10[66]等。

5 小 結

目前，對HA 蛋白的研究主要集中在2個領域，一個與頭部相關，另一個則與莖部相關，前者主要涉及IAV跨物種傳播的機制研究，后者則側重于相關藥劑的研發。最近，個別學者強調了HA-NA間的平衡關系，同時指出兩者具有一定的適應性才能穩定傳遞，這或許就解釋了為什么“H”和“N”雖然可以自由搭配但兩者組合并不是完全隨機；對于那些尚未出現過的HxNx，當下或許因為分子間的不平衡性和種群障礙而被限制，但卻是我們未來警惕的方向。Sun X等[4]也曾指出，H9N2病毒的內部基因具有較高的相容性，引起人類感染的H5N1、H5N6、H7N9和H10N8病毒都從其內獲得了內部基因，這就意味著H9N2病毒扮演著內部基因供體的角色。因此，IAV的廣泛分布將導致病毒的重新分類和不同基因型的產生，這在很大程度上增加了人獸共患病的風險。其次，抗流感病毒藥物的耐藥形勢變得越來越嚴峻，例如：M2離子通道抑制劑因普遍耐藥已不推薦用于臨床，神經氨酸酶抑制劑的耐藥株及新發耐藥位點與日俱增，上市不久的巴洛沙韋的耐藥株也已出現[67]。在未來，病原學監測、流行病學調查、生物學特性的剖析以及相關新藥的研發仍然是該領域的重點。隨著相關數據庫的健全以及抗流感藥物的不斷充實，或許有一天我們可以根據監測信息的回報，通過對藥物的規律性使用來主動調控甲型流感病毒的變異方向，進而減少一些突發事件的產生，也讓公衛大環境更加穩固。

利益沖突：無