大豆和豆粕水提物致草魚原代肝細胞損傷作用的研究

郁 濃 石瑤瑤 葉元土

(蘇州大學基礎醫學與生物科學學院, 水產動物營養與飼料省重點實驗室, 蘇州 215123)

大豆具有蛋白含量高、消化率高和氨基酸結構相對平衡等營養優點, 被廣泛應用于水產飼料中。然而, 大豆含有干擾魚體健康狀況的化學物[1],目前這些物質被歸為抗營養因子。豆粕是大豆經浸提或預壓浸提制油工藝的副產物, 脫溶和烘烤等處理可以部分去除一些熱不穩定抗營養因子, 如胰蛋白酶抑制劑、凝集素和致甲狀腺腫因子等[2], 已經有學者以豆粕基礎日糧飼喂水產動物, 不僅會引起腸炎性疾病[3], 而且會導致肝臟組織病變和生理異常。例如, 在石首魚的研究中證實了當日糧豆粕水平在44%以上時, 肝臟細胞核發生了偏移, 出現大量的脂質空泡[4]; 45%豆粕替代魚粉能夠破壞大黃魚肝臟組織結構[5]; 16%豆粕替代魚粉使凡納濱對蝦過度應激造成肝胰腺受損[6]; 我們實驗室進行了不同比例豆粕含量日糧對草魚肝胰臟結構與功能影響試驗, 結果表明在日糧中添加60%豆粕能夠引起草魚肝胰臟代償性增大[7], 肝胰臟的蛋白酶活力顯著下降[8]。這種異常是由一種或幾種抗營養因子, 例如皂甙、植物甾醇、寡糖和/或其他不明成分引起的[9—12]。目前文獻報道主要是引起腸炎機制, 其毒性成分種類尚不明確, 肝毒性作用與抗營養因子是否具有相關性有待研究。

肝臟作為魚類具代謝活性重要器官, 在營養物質的合成、轉運、儲存及外源物質的代謝等方面發揮重要作用[13,14]。采用體外培養草魚原代肝臟細胞, 能夠使代謝酶保持較高水平, 表現出完整的特異性功能, 是研究肝臟細胞體外代謝水平的較好模型[15]。在機體受到某些因子刺激時, 魚體內過量的氧化物積累會對核酸、蛋白質組分和生物膜等重要大分子造成損傷[16]。線粒體被認為是產生活性氧的主要部位, 線粒體中過量的活性氧能夠引起氧化應激, 增強細胞抗氧化系統的活性, 造成線粒體損傷, 甚至引起細胞凋亡[17]。營養物質作為一種信號, 肝細胞通過調節基因表達來改變代謝途徑,使其達到穩態, 基因組學利用高通量方法研究肝臟的生理反應和植物性膳食成分適應性反應[18]。

本文利用草魚肝臟分離的原代肝細胞為試驗對象, 以大豆和豆粕的水提物為實驗材料。在離體培養的肝細胞中定量加入不同劑量的水提物, 研究水提物對肝細胞活力和超微結構等的影響, 探討大豆和豆粕水提物對肝細胞的損傷作用。采用RNAseq測序技術, 考察對肝細胞全基因表達譜的影響,闡明損傷作用的位點和機制等, 不僅提高了我們對魚類肝細胞結構、代謝和免疫功能等方面的基本認識, 而且為修飾、消除或調節這些反應提供了潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

M199培養基(Hyclone, 美國)、胎牛血清(Gibco,美國)、胰蛋白酶(Gibco, 美國)、CCK-8(同仁化學,日本)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、還原性谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、線粒體膜電位檢測試劑盒(南京建成)、Hoechst 33258染色液、活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、可溶性糖試劑盒(碧云天)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(聯科生物)、CO2培養箱(HF 90/HF 240, Heal Force)、低速離心機、低速恒溫振蕩器、酶標儀(Gene Company Limited)、流式細胞儀(Beckman Coulter, 美國)、電子顯微鏡(型號: 120 kv HT-7700, 日立)。

1.2 SAE、SMAE的制備和成分分析

為了除去大豆中熱敏感抗營養因子和脲酶對試驗的影響, 模擬豆粕加工時溫度[19], 故采用高溫干熱法去除脲酶, pH增值法進行檢測脲酶活力, 當ΔpH<0.3時符合巴西豆粕質量指標。將熱處理后的巴西大豆和同一批次巴西豆大豆生產的豆粕(均購于張家港中糧集團)粉碎并過60目篩, 分別稱取等量豆粕和大豆, 均以1∶6(w/v)的比例加入蒸餾水, 在4℃冰箱中浸提24h, 不斷進行攪拌; 真空抽濾后得到濾液, 冷凍干燥后得到水提物凍干粉, 將其置于–80℃保存以備后續使用。對凍干粉進行成分分析,測定其得率、水分、蛋白質、脂肪、灰分、可溶性糖及小肽含量。水分是105℃烘干至恒重下測定的。蛋白質含量測定采用凱氏定氮法(GB/T 6432-2018); 石油醚索式抽提24h后, 測定粗脂肪含量(GB/T 6433-2006); 氣相色譜法對脂肪酸組成及含量進行測定; 550℃灼燒測定灰分含量; 高效液相色譜法(GB/T 22729-2008)測定肽組成和含量; 可溶性糖含量測定參照南京建成生物工程學院試劑盒說明書, 成分分析結果見表1。對大豆和豆粕凍干后的水提物進行了稱重, 凍干前后干物質的浸出率分別為23.19%和18.86%。SAE和SMAE中存在的主要化合物是蛋白、碳水化合物和灰分, 2種樣品在可溶性糖、蛋白和肽含量的相對含量上存在差異。

表1 SAE和SMAE的組成成分和小肽含量(g/100 g干物質)Tab. 1 Chemical compositions and peptides content of SAE and SMAE (g/100 g dry matter)

1.3 實驗魚的管理

實驗草魚平均體重為(15.0±5.0) g, 來自于蘇州市吳江區水產技術推廣站試驗場, 為一冬齡魚種。為了保障試驗草魚的生理健康, 將試驗用草魚暫養于蘇州大學魚類室內循環養殖系統中, 至少養殖2周以上, 每天投喂1次32%蛋白質和8%脂肪含量的草魚膨化料, 養殖水體溫度為(24.0±5.0)℃, 溶氧為(5.0±0.5) mg/L。

1.4 草魚原代肝細胞的分離和培養

參考秦潔等[20]的組織塊酶解法, 將實驗草魚浸泡在0.01%高錳酸鉀溶液中30min, 用75%的酒精擦拭體表, 放入超凈工作臺中, 取出肝臟組織, 用預冷的D-Hanks試劑清洗, 將組織塊剪切成1 mm3大小,加入3倍體積的0.25%胰酶放入振蕩培養箱中低速振蕩消化15min, 用70 μm細胞濾膜過濾組織塊, 1000 r/min離心1min, 去除上清液。加入D-Hanks液和紅細胞裂解液(1∶3)混合液以去除紅細胞, 再進行離心(1000 r/min, 4min)去除上清液, 輕洗2次離心后得到肝細胞, 用臺盼藍對細胞進行染色檢測, 活細胞的存活率>85%時進行后續試驗。用M199培養基(15%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL和兩性霉素0.25 μg/mL)重懸細胞進行計數, 調整細胞濃度后置于27℃、4.5% CO2的培養箱培養。

1.5 不同濃度水提物對草魚原代肝細胞活力的影響

將上述方法獲得的原代肝細胞(4×105個/孔)接種到96孔板中, 每孔100 μL。在培養24h后, 將SAE和SMAE用含5%胎牛血清的培養基稀釋成不同濃度, 使SAE和SMAE在細胞培養液中的終濃度分別為0、0.5、2.5、5.0和10.0 mg/mL, 每個濃度至少設置6個復孔, 在培養箱中繼續培養24h。采用CCK-8微板比色法檢測細胞活力。方法為每孔加入10 μL CCK-8溶液, 培養箱孵育2h, 在450 nm波長下檢測吸光度(OD值)。

1.6 透射電子顯微鏡檢測細胞超微結構變化

收集對照組和5.0 mg/mL SAE、SMAE 組細胞數量為6×106個, PBS洗2遍, 棄上清, 用2.5%戊二醛作前固定, 1%鋨酸作后固定, 梯度乙醇脫水后氧化丙烯浸透、環氧樹脂包埋、制超薄切片, 切片在200目銅網上收集, 干燥24h, 用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色, 在透射電鏡下觀察超微結構改變。

1.7 Hoechst 33285染色

Hoechst 33285是一種可以穿透細胞膜的非嵌入性熒光染料, 在染色體AT序列富集區域的小溝處與DNA結合, 在紫外光激發下可以發出亮藍色熒光[21]。為了進一步觀察細胞的凋亡特征, 使用熒光顯微鏡觀察Hoechst 33258試劑染色后的細胞核形態。方法為PBS清洗細胞2遍, 在4%多聚甲醛固定后添加100 μL的 Hoechst 33258試劑, 避光孵育30min。PBS洗滌3次去除背景色, 在熒光倒置顯微鏡檢測并拍照。

1.8 肝細胞相關抗氧化酶的檢測

采用微板法測定上清中LDH活力, 450 nm波長下多功能酶標儀測定吸光光度值。采用可見分光光度計法檢測上清中MDA的含量, 細胞內SOD和GSH按南京建成細胞專用試劑盒說明書處理, 分別在酶標儀450和405 nm處檢測OD值。

1.9 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡

肝細胞在含SAE和SMAE的培養基繼續培養24h后, 收集板中所有細胞, 清洗后加入195 μL Annexin V-FITC輕輕重懸細胞, 依次加入5 μL Annexin VFITC、10 μL PI染色液, 輕輕混勻。避光孵育15min后置于冰浴中, 用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡百分比。統計每個樣本中超過10000個細胞, 定量分析細胞凋亡率。

1.10 線粒體膜電位(MMP)檢測

收集細胞重懸于0.5 mL細胞培養液中, 加入0.5 mL JC-1染色工作液, 顛倒多次混勻, 在27℃培養箱中孵育40min。染色結束后沉淀細胞, 用JC-1染色緩沖液洗滌2次, 重懸后用流式細胞儀進行分析。

1.11 ROS檢測

加入熒光探針DCFH-DA于培養基中, 濃度為10 μmol/L, 27℃孵育細胞30min, 用胰酶消化細胞,加入培養基終止消化制成細胞懸液, 1000×g離心5min收集細胞, 用PBS洗滌2次, 再次離心收集細胞進行上機檢測。

1.12 轉錄組分析

基于以上結果, 轉錄本選用的是對照組、5.0 mg/mL濃度下的 SAE組和SMAE組細胞進行分析。RNA的質量、完整性和純度采用瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度計法。由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行RNA-seq測序, 采用 Illumina HiSeq測序平臺完成轉錄組測序, 構建Illumina PE文庫(**bp)進行2×150 bp測序, 對獲得的測序數據進行質量控制,利用生物信息學手段對轉錄組數據進行分析。

1.13 數據處理和分析

所有值均以至少3個批次獨立實驗的平均值±標準差表示。實驗用SPSS 22.0統計分析軟件進行單因子方差分析(One-way ANOVA), 組間差異顯著性用Duncan氏多重比較進行分析(Duncan’s multiple range test)。用GraphPad軟件(GraphPad Prism 6.0)進行統計檢驗和圖形繪制。P<0.05表示顯著差異, P<0.01表示極顯著差異。

2 結果

2.1 SAE和SMAE對草魚原代肝細胞活力的影響

如圖1所示, 在細胞培養液中加入SAE和SMAE后, 細胞相對活力下降。0.5和2.5 mg/mL濃度下的 SAE和SMAE組細胞相對活力與空白對照組相比無顯著性差異。5.0和10.0 mg/mL的 SAE劑量組相對細胞活力與濃度呈現負相關, 細胞活力分別為(78.10±8.57)%和(65.97±7.35)%, 與對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)。與之相同, 同劑量的SMAE組細胞相對活力分別為 (86.35±7.17)%和(80.26±7.08)%。

圖1 CCK-8法檢測相對細胞活力Fig. 1 Primary hepatocytes viability assessed by CCK-8 assay

2.2 肝細胞超微結構變化

如圖2所示, 正常組肝細胞核呈現圓形或橢圓形, 雙層膜結構清晰可見, 核仁位于核中央, 大而清晰, 細胞質均勻分布, 胞質內細胞器和內含物豐富,線粒體特別發達, 呈圓球形、橢圓形、彎月形、球桿狀或長桿狀, 內有清晰的細管狀嵴, 粗面內質網,常呈層狀排列, 膜表面有核糖體分布(圖2A和2B)。相比之下, SAE組(5.0 mg/mL)細胞的內質網與線粒體數量減少, 且腫脹現象明顯。肝細胞內聚集了大小不一的大脂滴(圖2C和2D)。SMAE組(5.0 mg/mL)細胞超微結構發生了改變, 包括核染色質沿核膜的環狀凝結、稀疏的光密度、胞質、線粒體腫脹和數量的減少、內質網的腫脹(圖2E和2F)。上述結果表明, SAE和SMAE均能導致肝細胞微觀結果的顯著性改變, 主要的變化在細胞核和線粒體的微觀結構。

圖2 肝細胞超微結構觀察Fig. 2 Ultrastructural observation of Hepatocytes

2.3 Hoechst 333258染色

選用5.0 mg/mL濃度組的 SAE和SMAE組肝細胞被Hoechst 33258染色, 如圖3所示, 熒光顯微鏡下可見對照組細胞大小一致, 形狀為圓形, 且亮度均一。經水提物培養后的細胞藍色熒光強度減弱, 核縮小, 形態不規則, 邊緣模糊, 可見少量的核碎片,染色不均勻(染色質凝集), 染色質邊緣化等形態變化。

圖3 Hoechst 333258熒光染色觀察細胞核形態變化Fig. 3 Nuclear morphological changes were observed by hoechst 333258 fluorescent staining

2.4 SAE、SMAE對草魚原代肝細胞抗氧化相關酶活力的影響

圖4A顯示的是細胞上清液LDH含量的變化,可作為評價細胞損傷的指標。0.5 mg/mL濃度下的SAE組和0.5、2.5 mg/mL濃度下的SMAE組細胞上清液中LDH含量較低, 與對照組相比無顯著性差異, 2.5 mg/mL SAE組細胞外液LDH與對照組相比有顯著性差異(P<0.05), 在兩組高劑量濃度(5.0和10.0 mg/mL)下, 細胞釋放到培養液中的LDH含量與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。如圖4B所示,兩組細胞上清液的MDA含量趨勢呈現上升狀態(P<0.01)。如圖4C和4D所示, 與對照組相比, 當SAE和SMAE添加量為5.0和10.0 mg/mL時, 還原型谷胱甘肽(GSH)含量差異極顯著(P<0.01), 且SOD活性與對照組相比均有顯著差異(P<0.01)。在同濃度下, SAE組細胞上清液中LDH和MDA含量高于SMAE組, 抗氧化酶活力低于SMAE組。

圖4 SAE和SMAE對草魚原代肝細胞抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effects of SAE and SMAE on antioxidant enzyme activity in primary hepatocytes of grass carp

2.5 SAE和SMAE誘導肝細胞凋亡

對細胞凋亡分析結果如圖5所示, 隨著水提物濃度的升高, 細胞早期凋亡率升高。低劑量組(0.5和2.5 mg/mL)與對照組的凋亡比沒有顯著性差異, 5.0和10.0 mg/mL濃度SAE組凋亡率為(22.55±4.35)%和(55.03±2.76)%, SMAE組的凋亡率分別為(32.67±5.79)%和(37.11±8.57)%, 均與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)。該實驗結果表明, 水提物繼續培養24h會誘導草魚的肝臟細胞發生凋亡, 凋亡細胞數量呈劑量依賴性增加。

圖5 SAE和SMAE對草魚原代肝細胞凋亡的影響Fig. 5 Effects of SAE and SMAE on the apoptosis of primary hepatocytes in grass carp

2.6 SAE和SMAE誘導肝細胞線粒體損傷

流式細胞術檢測結果顯示(表2), 實驗組細胞內平均熒光強度顯著高于對照組(P<0.01), SAE和SMAE (5.0和10.0 mg/mL)培養肝細胞24h后, 可升高細胞內ROS水平。線粒體通過內在途徑在細胞凋亡中發揮關鍵作用, 細胞膜電位的改變是誘導細胞凋亡的關鍵, 與對照組相比, SAE組(2.5、5.0和10.0 mg/mL)和SMAE組(5.0和10.0 mg/mL) MMP較對照組有不同程度的下降(P<0.05, 表3)。

表2 SAE和SMAE對原代肝細胞活性氧(ROS)形成的影響Tab. 2 Effects of SAE and SMAE on ROS formation in primary hepatocytes

表3 SAE和SMAE對原代肝細胞線粒體膜電位(MMP) 的影響Tab. 3 Effects of SAE and SMAE on MMP in primary hepatocytes

2.7 基因差異表達和通路分析

對照(Con)組、5.0 mg/mL濃度下的 SAE組和SMAE 組細胞培養24h后肝細胞轉錄組中對照組和處理組分別采用TPM(Transcripts Per Million reads)計算方法計算各個基因表達量, 默認參數: p-adjust<0.05、|log2FC| ≥1, 即具有統計學意義, 對部分DEGs進行整理結果見表4。如圖6所示, SAE組與Con組相比共有上調基因337個, 下調基因532個;SMAE組與Con組相比共有上調基因440個, 下調基因1011個。將篩選所得的DEGs分別從生物學過程(Biological process, BP)、分子功能(Molecular function, MF)和細胞成分(Cellular component, CC) 三個層面進行GO功能富集, 并采用KEGG通路分析研究DEGs可能參與調控的相關信號通路。

圖6 SAE和SMAE引起原代肝細胞差異表達火山圖和各組DEGs韋恩圖Fig. 6 SAE and SMAE induced differential expression of primary hepatocytes in volcanic and DEGs Venn diagrams

表4 差異表達基因列表Tab. 4 List of differentially expressed genes

由圖7可見, Con組與SAE組相比, 可顯著富集TOP15條途徑, BP Term包括蛋白水解負調控(Negative regulation of proteolysis)、水解酶活性的負調控(Negative regulation of hydrolase activity)、肽酶活性的負調控(Negative regulation of peptidase activity)、細胞內脂類代謝(Cellular lipid metabolic process)和類異戊二烯代謝過程(Isoprenoid metabolic process)等。CC Term主要與細胞外空隙(Extracellular space)有關。所富集到的MF Term主要和肽酶抑制劑活性(Peptidase inhibitor activity)、肽鏈內切酶調節活性(Endopeptidase regulator activity)和肽酶調節活性(Peptidase regulator activity)有關。Con組與SMAE組相比, 主要涉及氧化還原過程(Oxidation-reduction process)、催化活性的負調節(Negative regulation of catalytic activity)、內肽酶活性的負調控(Negative regulation of endopeptidase acti-vity)、水解酶活性的負調控(Negative regulation of hydrolase activity)等BP Term。在CC Term中主要與細胞外區域部分(Extracellular region part)有關,在MF Term中, DEGs主要集中在氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、酶抑制劑的活性(Enzyme inhibitor activity)及肽酶調節。

圖7 SAE和SMAE引起原代肝細胞DEGs GO富集分析Fig. 7 SAE and SMAE caused DEGs GO enrichment in primary hepatocytes

對KEGG通路富集分析, DEGs可顯著富集到20條信號通路。如圖8所示, 影響最大的是補體和凝血級聯, 其次為甾體生物合成、PPAR信號通路、細胞因子的相互作用、脂肪消化和吸收、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、萜類骨架生物合成和甘油三酯代謝等, 這些通路可能作為SAE引起肝細胞損傷的發生機制。SMAE組肝細胞顯著富集到30條信號通路, 影響最大的是補體和凝血級聯, 其次是細胞因子的相互作用、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、甘油三酯代謝、NF-κB信號通路、TNF信號通路、谷胱甘肽代謝、糖酵解/糖異生和細胞色素P450等。這些結果提示, SAE可能更多的是通過誘導蛋白質與脂質代謝異常, 參與氧化應激過程, 進一步導致肝細胞炎癥和壞死的發生。

圖8 SAE和SMAE引起原代肝細胞DEGs KEGG富集分析Fig. 8 SAE and SMAE caused DEGs KEGG enrichment in primary hepatocytes

3 討論

3.1 SAE、SMAE誘導原代肝細胞線粒體途徑凋亡

肝細胞凋亡是肝損傷和癌變的機制之一。誘導細胞凋亡的途徑很多, 線粒體凋亡途徑是脊椎動物的主要生理凋亡途徑[22]。線粒體是細胞能量代謝中心, 線粒體動力學被認為在維持細胞內環境穩定方面具有重要的生理作用[23]。線粒體結構異常和功能障礙是壞死的基本特性, 伴隨著線粒體膜通透性的改變, MMP的降低, Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成員發生蛋白質的加工修飾, 易位到線粒體的外膜上, 引發級聯反應, 最終觸發細胞凋亡[24]。

SAE和SMAE 能夠誘導肝細胞超微結構改變,結合Hoechst染色結果, 包括細胞核凝結和核破碎,光密度稀疏, 線粒體數量減少和腫脹現象明顯, 出現大量脂滴堆積等。SAE和SMAE能降低肝細胞線粒體膜電位。與對照組相比, 各濃度水平SAE組細胞MMP水平分別為74.02%、40.34%、21.43%和9.87%, 而SMAE組中MMP水平僅略有升高。線粒體內膜的通透性屏障造成ATP合成功能障礙, 影響細胞活力。糖代謝過程與細胞能量供給密切相關,在糖酵解過程、三羧酸循環通路中, 葡萄糖激酶(GCK)表達上調, 丙酮酸脫氫酶基因(PDHA)、果糖-6-磷酸(G6PC)、乙醇脫氫酶(ADH)、果糖-1, 6-二磷酸(FBP)、絲氨酸-丙酮酸轉移酶(AGXT)表達受到抑制, 不僅糖的合成、降解受到了阻礙, 而且能量供應出現障礙。其中AGXT在線粒體和過氧化物酶體中具有雙重代謝調節作用[25]。

在大西洋鮭的日糧中豆粕含量的升高會引起腸上皮細胞凋亡數量增加, 遠端腸體指數下降[10],及形態學的改變[26], 同樣在Wistar大鼠的研究中發現, 飼喂過生大豆的鼠小腸黏膜內腸上皮細胞損傷最高[27]。通過流式細胞術檢測10.0 mg/mL SAE組肝細胞凋亡百分比, 達到(55.03±2.76)%, SMAE組的凋亡百分比達到(37.11±8.57)%, 與對照組相比均有顯著差異(P<0.01), Bcl-2基因顯著下調, 表明水提物能夠引起原代肝細胞凋亡。

3.2 SAE和SMAE引起原代肝細胞氧化損傷

ROS是指所有需氧細胞在一系列代謝反應和各種刺激物作用下產生的副產物[28]。線粒體被認為是ROS產生的主要場所, 這是在有氧條件下內源性的、連續的生理過程。線粒體呼吸鏈是由超氧陰離子歧化產生ROS的主要來源, 同時也是ROS破壞作用的重要靶點[29]。

在本研究中, SAE和SMAE在5.0 mg/mL濃度下誘導細胞內ROS過量產生, 說明草魚原代肝細胞表現出氧化應激。通過對細胞相關酶活力檢測發現,細胞上清液中LDH和MDA水平明顯升高, 細胞內液中抗氧化酶(SOD和GSH)活性明顯低于正常對照組(P<0.01), 反映肝細胞膜損傷, 導致脂質氧化, 抗氧化酶系統受損, 促進細胞炎性反應。肝細胞轉錄組結果顯示細胞色素P450相關基因(CYP24A1、CYP4B1、CYP4V2、CYP2K和CYP2U1)參與外源性物質的氧化代謝, 參與NADPH依賴的電子傳遞途徑[30]。谷胱甘肽過氧化物酶以還原型谷胱甘肽為電子供體底物, 催化過氧化氫或有機過氧化物還原成水或相應的醇[31], 谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)基因表達上調, 超氧化物歧化酶(SOD3)基因表達水平顯著下降, 表明SAE和SMAE能致肝細胞氧化損傷。

3.3 豆粕中對肝細胞損傷的物質來自于大豆

豆制品作為重要的膳食蛋白來源, 在人類和動物中得到了廣泛的應用。但是, 大豆中生物活性物質的高含量使它成為一種需要關注的膳食補充劑[32]。這些物質在魚類體內不能正常代謝, 可引起一系列主要與消化生理、健康和代謝相關的作用, 導致腸黏膜屏障受損, 增加物質對肝臟的通透性, 進而引起代謝和免疫反應[33]。有研究表明, 在30%大豆營養脅迫下, 通過大西洋鮭的轉錄組水平發現, 補體級聯反應和肉堿O-棕櫚酰轉移酶基因顯著上調, 通過合成輔酶A參與脂肪酸的氧化, 肝臟接近酮體狀態, 表明大豆誘導的營養脅迫對魚類肝臟反應的不利影響[18]。

本研究中轉錄組結果顯示, 對肝細胞影響最大的是補體和凝血級聯反應。白細胞介素IL-12由p35和p40亞基組成, 促進細胞免疫和炎癥反應, 在本研究中, Toll樣受體1(TLR1)基因和IL12A基因表達上調。當肝細胞受到水提物中危害成分損傷刺激后, 觸發TLR1介導的獲得性免疫, 導致大量的炎癥細胞因子產生, 同時伴隨著中性粒細胞激活(CXCR4和CCR9基因上調), 分泌產生細胞外基質, 基質金屬蛋白酶9 (MMP9)表達上調, 降解細胞外基質,引起肝細胞免疫反應, 加重肝細胞損傷。這些結果表明, 豆粕能夠對魚類免疫機能和生理健康產生負面影響。

Gupta等[34]研究發現0.4%(w/v)大豆蛋白水解物(60%肽/氨基酸和20%碳水化合物)能夠促進倉鼠卵巢(CHO)細胞生長。而大豆異黃酮染料木素促進人和大鼠乳腺上皮細胞和仔豬肝細胞凋亡[35,36]。大豆凝集素能夠降低豬腸柱狀上皮細胞整合素的表達, 從而誘導細胞凋亡[37]。有研究表明, 大豆中的Glyceollins能夠通過MMP去極化引起小鼠肝癌細胞凋亡[38]。大豆作為一個復雜的組成系統, 其對體外培養細胞的影響尚未得到全面的綜述。通過化學成分分析結果顯示, SMAE的可溶性糖含量下降, 小肽含量升高, 這都與加工相關, 在脫脂熱處理的過程中可能發生了一些成分的改變(化學修飾反應)[39]。水提物中含有引起草魚肝細胞氧化損傷的物質, 且這類物質來自于大豆自身的組成物質。SAE和SMAE 引起的肝細胞損傷可能有多種途徑, 試驗結果表明, ROS介導的線粒體可能是大豆誘導原代肝細胞氧化應激和凋亡的重要途徑之一。

4 結論

本文研究結果表明, 在大豆和豆粕的水提物中存在有對草魚原代離體肝細胞損傷的物質, 且豆粕水提物中損傷物質是來源于大豆而不是大豆生產豆油和豆粕的過程中。氧化損傷為主要作用方式,能夠影響肝細胞核與線粒體的結構和功能, 損傷作用的路徑為: 對細胞代謝產生干擾, 細胞內ROS增加、抗氧化能力下降, 細胞核與線粒體結構和功能改變, 并導致細胞活力顯著下降, 最終引起細胞凋亡。雖然本文分析了部分營養物質成分和含量, 但具體的損傷物質種類還有待分析和鑒定, 這是一個更為細致和長期的研究工作。