大瀧六線魚仔稚魚頭部骨骼發育觀察

張 偉 劉 瑩 官曙光 于超勇 趙文溪 宋愛環 李紹彬

(山東省海洋生物研究院, 山東省海水養殖病害防治重點實驗室, 山東省海水健康養殖工程技術研究中心, 青島 266000)

魚類骨骼系統包括外骨骼與內骨骼, 外骨骼主要由鱗片和鰭條等組成, 內骨骼主要由主軸骨骼和附肢骨骼組成。魚類骨骼發育方式可分為兩種, 一種是由間充質細胞直接分化為骨細胞并骨化成骨骼, 即膜內化骨; 另一種是由間充質干細胞先分化為軟骨細胞, 軟骨細胞再經骨化成骨骼, 即軟骨內化骨[1,2]。魚類骨骼發育是一個非常復雜的過程,其會影響魚類的外部形態與功能需求[3], 硬骨魚類因種類不同, 在骨骼發育方面存在明顯的差異, 目前, 國內外很多學者已圍繞魚類骨骼系統發育開展了大量的研究, 摸清了鱖(Siniperca chuatsi)[1]、鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)[4]、赤點石斑魚(Epinephelus akaara)[5]和遠東擬沙丁魚(Sardinops melanostictus)[6]等硬骨魚類的骨骼發育時序規律,研究發現, 魚類早期骨骼發育遵循頭部優先發育的原則, 且骨骼早期發育時序的不同與仔、稚魚的胚后功能發育和對環境的適應性密切相關。

大瀧六線魚(Hexagrammos otakii)隸屬于六線魚科Hecagrammidae、六線魚屬Hexagrammos, 為冷溫性近海底層魚類, 主要分布于朝鮮、日本及中國黃渤海域, 在我國山東和遼寧等地的近海多巖礁海區分布廣泛[7]。因大瀧六線魚肉質細膩、味道鮮美、生長迅速、經濟價值較高, 故其不僅是我國北方網箱養殖的理想種類, 也是開拓礁灣增殖和發展游釣業的理想品種[8]。目前, 對于大瀧六線魚的研究主要集中在繁育生物學、遺傳學、資源評價和生態生長特性等方面的研究[7,9,10], 在大瀧六線魚早期發育方面, 胡發文等[11,12]對大瀧六線魚胚胎發育過程中各期特征及發育時間進行了詳細的觀察記錄, 同時也對仔稚魚頭部和尾部等外部形態發育過程進行了詳細的描述; 于超勇等[13]對大瀧六線魚仔稚魚脊柱及附肢骨骼系統的發育過程進行了詳細的觀察與分析。但是, 目前國內外尚未有對大瀧六線魚仔稚魚的頭部骨骼早期發育過程的詳細描述。頭部骨骼作為魚類骨骼的重要組成部分, 與魚類攝食和呼吸功能發育密切相關, 同時頭部的畸形發育也會對苗種的存活率產生極大的影響[14], 蓋珊珊等[15]對在人工繁育大瀧六線魚仔稚魚骨骼畸形進行統計與分析時發現, 頭部骨骼畸形的主要發生時期為16—20 DPH(孵化后日齡), 且為仔稚魚變態期高死亡率的主要原因, 因此摸清大瀧六線魚頭部骨骼早期發育規律, 對于有效鑒定人工繁育過程中頭部骨骼畸形的發生至關重要。本研究通過軟骨-硬骨雙染色方法[16], 對大瀧六線魚的仔稚魚發育過程中頭骨的形態變化進行連續觀察與分析, 摸清了大瀧六線魚仔稚魚頭部骨骼不同骨元件的發育時序與骨化階段, 闡釋了頭部骨骼的生長發育規律與其特殊性, 旨在為揭示大瀧六線魚頭部骨骼早其發育與攝食功能之間的關系提供科學依據, 同時, 為提升人工繁育條件下大瀧六線魚畸形鑒定水平及豐富大齡六線魚早期生活史奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 大瀧六線魚仔稚魚培育

大瀧六線魚仔、稚魚早期發育的各階段樣本取自威海圣航水產科技有限公司。實驗親魚取自大連黑石礁海區海上網箱養殖的2—3齡大瀧六線魚, 室內標準條件養殖, 利用腹部擠壓法獲得卵及精液, 將卵與精液混合均勻, 令魚卵整形為大小為10—15 cm左右的方形、厚度為2—3層魚卵的平面薄片, 2min后加入海水, 15min后受精卵片凝固變硬, 將卵片置于水槽中, 流水孵化。孵化條件為: 水溫16—17℃, 鹽度28—30, pH 7.8—8.2, 溶解氧≥5 mg/L, 光照強度為500 lx。受精卵經過21d左右可孵化出仔魚; 初孵仔魚轉移到培育池中, 養殖水溫為14—15℃, 鹽度28—30, pH7.8—8.2, 溶解氧≥5 mg/L, 曝氣, 光照強度控制在500—1000 lx; 從初孵仔魚至5 DPH為靜水培育, 6 DPH后隨魚苗的生長逐步增大換水量, 6—20 DPH換水量為60%,21—40 DPH換水量為100%, 41—60 DPH換水量達150%, 60日齡后隨魚苗的生長及攝食量的增加,換水量達200%到400%; 大瀧六線魚仔魚孵化后,即已開口, 魚苗孵化初期至25 DPH, 每日向培育池中添加新鮮小球藻, 5—25 DPH投喂輪蟲, 10—60 DPH投喂鹵蟲無節幼體, 50 DPH后開始投喂配合餌料。

1.2 大瀧六線魚仔稚魚樣本采集及保存

自大瀧六線魚仔魚孵化后, 每天早上投喂餌料前, 自2個培育池中分別隨機取樣50—60個, 每組樣品隨機取20尾仔魚進行觀察分析, 采樣策略為: 初孵仔魚至31 DPH每日取樣1次, 35—60 DPH每5日取樣1次; 在樣品采集后, 用MS-222進行麻醉, 待仔稚魚完全沉入燒杯底部后, 將其收集存入10%甲醛溶液中, 置于4℃冰箱中保存, 保存期間定期更換新鮮10%甲醛溶液。

1.3 大瀧六線魚仔稚魚骨骼染色方法

大瀧六線魚仔稚魚骨骼染色方法主要參照楊安峰[16]采用的軟骨-硬骨雙染色方法, 其操作步驟主要包括蒸餾水清洗浸泡、軟骨染色液(10 mg阿利新藍8GX＋80 mL95%乙醇溶液＋20 mL冰乙酸)染色、純乙醇脫水(浸泡1—3d)、乙醇溶液梯度復水(95%、75%、40%和15%)、胰蛋白酶溶液(30 mL飽和硼酸鈉水溶液＋70 mL蒸餾水＋1 g胰蛋白酶)消化處理、硬骨染色液(0.5%KOH＋足夠的茜素紅飽和溶液, 直至溶液呈現深紫色)染色、0.5%KOH-甘油合劑梯度脫色(3∶1、1∶1和1∶3)、3%H2O2溶液色素漂白、加有麝香草酚的純甘油密封保存。

1.4 大瀧六線魚骨骼染色標本觀察及相關數據采集

染色處理好的仔稚魚樣品在Olympus SZ61型體視顯微鏡下進行觀察, 詳細記錄仔稚魚各發育時期的頭部骨骼特征進行觀察, 并利用數碼相機顯微照相進行照片采集, 采集的圖像用Adobe Photoshop CS軟件(www.photoshop.com)進行處理。從初孵仔魚到60日齡仔稚魚的全長用游標卡尺測量(0.01 mm)。所有的全長數據均用SPSS 16.0軟件(www.ibm.com)進行分析, 統計數據表現為Mean±SD的形式。

2 結果

2.1 大瀧六線魚顱骨發育過程

大瀧六線魚初孵仔魚已具備骨小梁、第一基鰓軟骨、4對角鰓骨和篩板等顱骨骨骼元件(初孵仔魚, 圖版Ⅰ-1), 此外緣帶出現在眼睛上方; 當仔魚全長達到(6.71±0.27) mm(4 DPH, 圖版Ⅰ-2)時, 第二基鰓軟骨出現在第一基鰓軟骨后端, 緣帶向后延伸, 軟骨橋出現, 將頭蓋骨分為前鹵和后鹵, 當全長達到(8.52±0.16) mm(9 DPH, 圖版Ⅰ-3)時, 3對鰓下骨, 第五對角腮骨可見(表1), 全長至(10.12±0.31) mm(13 DPH, 圖版Ⅰ-4)時, 4對鰓上骨、鼻骨、中篩板和側篩板相繼出現; 全長至(25.16±1.36) mm(35 DPH,圖版Ⅰ-8)時, 頂骨和額骨出現, 鼻骨開始發生骨化,另外, 角鰓骨從中間開始骨化, 第一基鰓軟骨與鰓下骨的連接處開始骨化; 全長至(31.43±1.54) mm(50 DPH, 圖版Ⅰ-9)時, 副蝶骨出現, 緣帶和鼻骨完成骨化; 最后, 篩板開始發生骨化(表1), 至全長為(35.38±2.79) mm(60 DPH, 圖版Ⅰ-10)時, 大瀧六線魚顱骨骨骼骨化完成。

表1 大瀧六線魚仔稚魚頭部骨骼發育時序Tab. 1 The time and progress of cranium development corresponding total length (TL) in Hexagrammos otakii

2.2 大瀧六線魚仔稚魚頜骨發育過程

大瀧六線魚初孵仔魚已存在部分頜骨軟骨元件,如: 邁克爾氏軟骨、腭方骨、舌棒骨、舌續骨和下舌骨等, 全長至(10.12±0.31) mm(13 DPH, 圖版Ⅰ-4)時,邁克爾氏軟骨背中部突出現, 翼骨突出現在腭方骨前端并向篩板方向延伸, 舌棒骨后端逐漸變寬; 全長至(12.22±0.42)—(16.17±0.40) mm時(16—21 DPH, 圖版Ⅰ-5、6), 基舌骨出現在第一基鰓軟骨前方, 與此同時, 下舌骨、上頜骨、前頜骨和鰓絲相繼出現, 邁克爾氏軟骨前端逐步發生退化; 全長至(18.02±1.27) mm(23 DPH, 圖版Ⅰ-7)時, 齒骨開始骨化, 齒骨為大瀧六線魚骨骼中最先發生硬骨化的骨骼元件; 全長至20.00 mm(26 DPH)時, 前頜骨和上頜骨開始骨化; 至全長為(25.16±1.36) mm(35 DPH, 圖版Ⅰ-8)時, 前頜骨和上頜骨骨化完成, 大瀧六線魚腭方骨已逐漸退化形成方骨, 舌續骨也逐漸退化形成續骨和舌頜骨, 另外, 同角鰓骨相同, 舌骨棒從中間開始骨化, 全長至(31.43±1.54) mm(50 DPH, 圖版Ⅰ-9)時, 基舌骨和下舌骨開始發生骨化, 至全長為(35.38±2.79) mm(60 DPH,圖版Ⅰ-10)時, 大瀧六線魚頜骨骨骼中, 除舌棒骨外,基本骨化完成(表1)。

圖版Ⅰ 大瀧六線魚仔稚魚頭部骨骼發育時序PlateⅠ Time and developmental process of the skeleton in head of larva and juvenile H. otakii

2.3 大瀧六線魚仔稚魚板狀骨與鰓蓋骨發育過程

板狀骨: 后翼骨、外翼骨和內翼骨于35 DPH前后出現軟骨并于50 DPH逐漸開始硬骨化, 而續骨、舌頜骨和方骨則于26—35 DPH期間直接發育為硬骨(表1)。

鰓蓋: 前鰓蓋骨和鰓蓋骨于26 DPH前后直接以硬骨化的形態出現, 而下鰓蓋骨和間鰓蓋骨則于35 DPH前后以硬骨化形態出現; 全長至(31.43±1.54) mm(50 DPH, 圖版I-9)時, 后翼骨和前鰓蓋骨完成骨化,同時, 角腮骨由中間向兩端骨化, 鰓蓋骨、下鰓蓋骨及鰓蓋條發生骨化(表1)。

3 討論

3.1 大瀧六線魚仔稚魚頭部骨骼發育與早期攝食能力的適應性關系

魚類骨骼發育過程非常復雜, 其頭部骨骼尤為細碎繁瑣, 而頭部骨骼早期發育時序與不同魚種仔稚魚對環境的適應息息相關[17]。本文通過雙染色法對大瀧六線魚的頭骨發育進行了最直觀的觀察與分析, 比較清晰地觀察到了頭部不同骨骼的發育時序及骨化順序, 大瀧六線魚仔魚頭部骨骼的變化明顯的反映出與攝食功能需要的統一。

與亞東鮭(Salmo trutta fario)[18]和海水青鳉(Oryzias melastigma)[19]相似, 大瀧六線魚頭部骨骼發育始于胚胎時期, 初孵仔魚已具備邁克爾氏軟骨、骨小梁和角鰓骨等與仔魚攝食相關的頭骨元件。相比于大菱鲆(Scophthalmus maximus)[20]和赤點石斑魚[5]等鱸形目魚類初孵仔魚無任何頭部骨骼元件,大瀧六線仔魚可以更早地應用頭部骨骼進行外源性養分的捕食攝取, 這無疑可以大幅提高其仔魚的生存率, 更加適應北方海域尤其是秋冬季的嚴寒及食物短缺[21,22]。在魚類早期個體發育過程中, 從內源性營養轉變為外源性營養是一個非常關鍵的時期, 尤其是與攝食相關骨骼的發育, 頭部骨骼在這一時期由簡單結構逐步發育為具有功能分區的復雜結構。與邱麗華等[23]的報道相似, 6 DPH, 在腭方骨、舌棒骨、舌續骨和下舌骨等骨骼的發育情況下, 大瀧六線魚頜弓初步成型, 頜弓對仔魚口部的啟閉和捕食十分重要, 六線魚開始開口捕食外源性食物, 該階段標本腹部觀察到的輪蟲幼蟲殘體可印證這一結論; 8—48 DPH, 頜骨、方骨、頂骨、額骨和鼻骨已相繼骨化, 頜弓由軟骨轉變為硬骨增強了仔魚的咬合能力和吞咽能力和舌弓硬骨化加強了腦顱與咽顱的連接而將頜弓緊緊懸系在腦顱上和鰓弓的硬骨化使得咽齒逐漸發育完善可對捕食物初步加工并進一步增強捕食能力和鰓蓋的硬骨化則提高了鰓的呼吸功能使得仔魚運動嗅探能力大幅提升, 此時仔魚從剛具備采食輪蟲幼體的能力發展到捕食相對更加兇猛和更大型的鹵蟲成體, 捕食能力不斷加強, 大量的外源性營養攝入體內, 因此大瀧六線魚進入快速生長期, 這與胡發文等[12]的研究相吻合; 49—60 DPH, 大瀧六線魚頭骨骨骼除舌棒骨外基本骨化完成, 腦顱鼻區和耳區的逐步成熟其嗅探能力和體調節平衡能力不斷提升, 而咽顱頜弓、舌弓、鰓弓和鰓蓋骨的硬化成熟則顯著提升了仔稚魚的咬合、捕食和吞咽能力, 此階段大瀧六線魚已可以采食比鹵蟲更加堅硬的配合餌料, 幼魚生長漸趨穩定。綜上所述, 大瀧六線魚頭部骨骼的發育為其外源性攝食能力的建立與逐級增強提供了基本條件。

3.2 大瀧六線魚仔稚幼魚頭部骨骼的發育特殊性

不同魚類仔稚魚頭部骨骼發育時序不盡相同,就發育周期而言, 大瀧六線魚頭部骨骼發育耗時較長, 大瀧六線魚頭部骨骼發育始于胚胎時期, 60日齡基本發育完全, 發育耗時較日本鬼鲉(Inimicus japonicas)[24]和大黃魚[25]等硬骨魚類長, 這可能與大瀧六線魚低溫生長環境有關。

與偏向植食性的雜食性魚類團頭魴(Megalobrama amblycephala)[26]相比, 偏肉食性的大瀧六線魚與其頭骨發育有諸多不同之處, 團頭魴初孵仔魚咽骨發育并不完善, 但其上頜骨和鰓蓋骨在孵化后4—5 DPH即可膜質化, 為保證團頭魴的正常呼吸與攝食, 其鰓弓軟骨和咽齒于卵黃囊消失前就開始出現, 但其鼻區發育較為遲緩。而在大瀧六線魚的頭骨發育過程中, 呼吸與攝食相關的頭部骨骼也較早發育, 大瀧六線魚鰓基軟骨、角腮骨和鰓下骨主要集中在4—9 DPH發育, 這部分骨骼所包裹的鰓腔為仔魚鰓絲的發育提供了優良條件, 保證了仔魚的正常呼吸; 舌續骨、腭方骨、邁克爾氏軟骨背部中突、舌棒骨和莖舌骨集中在4—9 DPH發育, 這部分骨骼支撐包裹口腔以保護其內部器官的發育, 如牙齒的發育就主要依靠頜骨中的腭骨為基礎, 這部分骨骼的發育為仔魚能夠進行強有力的捕食活動奠定了堅實的基礎; 但大瀧六線魚在孵化之初最先發育的頭部骨骼為篩板、側篩板、骨小梁和緣帶, 這部分骨骼主要圍繞鼻區發育, 主要作用是包裹形成鼻囊以保護其內部嗅覺器官的發育, 提升六線魚嗅探外源營養的能力, 由此可以推測, 較于植食性魚類, 嗅覺在肉食性大瀧六線魚早期攝食過程中起到重要作用。與此同時, 通過觀察實驗結果我們發現: 相較于鼻區、鰓弓和舌弓的優先發育, 大瀧六線魚眼區和耳區的發育相對滯后, 蝶骨、頂骨和翼骨系的骨化甚至要等到20—25 DPH才能開始, 這種發育模式的形成可能是由于在大瀧六線魚進化歷程中, 為了在生存競爭中贏得優勢, 自然選擇優先篩選出嗅探、捕食和吞咽能力最為突出的家系, 而淘汰了以視覺與聽覺為優勢的家系。

本實驗通過對大瀧六線魚頭骨的發育過程進行觀察與分析, 確定了大瀧六線魚頭部骨骼發育時序及特征, 有助于進一步了解其早期發育階段的功能趨向。