納米緩釋丁酸鈉對草魚生長性能、血清生化指標、腸道黏膜形態及PepT1基因表達的影響

唐建洲 曹申平 瞿符發 彭 亮 劉 臻 侯德興 賀 喜

(1. 湖南農業大學動物科技學院, 長沙 410128; 2. 長沙學院生物與環境工程學院, 水生動物營養與品質調控湖南省重點實驗室, 長沙 410022)

隨著草魚(Ctenopharyngodon idella)養殖向規模化和集約化模式的發展, 其對飼料的需求量逐年增加, 而由于魚粉價格的不斷攀升, 飼料廠家往往采用價格低廉的植物性蛋白替代魚粉來降低生產成本, 如豆粕、菜粕和棉籽粕等。植物蛋白源替代魚粉可有效節約飼料成本, 同時, 還可以緩解魚粉供給側緊張, 減少因魚粉需求增加而導致過度捕撈帶來的一系列漁業資源破壞和生態失衡等問題[1]。一般來說, 隨著植物性蛋白源替代比例升高, 養殖動物對飼料利用能力降低, 當植源性原料大量使用時還會引起魚類腸道炎癥, 嚴重則會造成魚類死亡。研究表明, 植源性原料的一個重要危害就是其所含有的抗營養因子能損傷魚類小腸絨毛細胞, 造成水產動物的腸道損傷[2]。另外, 由于魚類對植物性飼料的利用率不高, 未消化吸收的營養物質直接排到水域環境, 造成水中氨氮過高, 水體富營養化,養殖水域環境嚴重污染[3]。丁酸鈉是一種重要的飼料添加劑, 其能被腸道快速吸收, 具有促進腸道細胞增殖和成熟, 維持腸黏膜完整性, 促進小腸對營養物質的消化吸收的作用[4,5]。在仔豬(Sus domesticus)[6,7]和雛雞(Gallus gallus domesticus)[8]中的研究發現, 丁酸鈉能降低動物的餌料系數, 提高其增重率。同時, 還能夠調節動物腸道內微生物的生態平衡, 提高機體自身抗免疫力[9,10]。在水產動物飼料中丁酸鈉的應用也有相關報道。研究表明, 其對西伯利亞鱘(Acipenser baeri)[11]和南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)[12,13]的生長性能具有顯著的促進作用, 但是有關丁酸鈉對水生動物腸道蛋白質及小肽吸收轉運影響的研究卻鮮有報道。丁酸鈉的活性成分是丁酸, 而丁酸具有揮發性和難聞的酸臭味,在應用中, 為了克服這些缺點并達到其在飼料投喂過程的增產等效果, 一般會采用包膜技術將丁酸鈉進行各種包膜處理, 達到定點和延時釋放的目的[14]。本研究擬在草魚飼料中添加不同劑量的納米緩釋丁酸鈉(專利號: ZL2016103275999), 利用養殖生長實驗, 探討納米緩釋丁酸鈉對草魚生長性能、血清生化指標、腸道上皮細胞的增殖及PepT1基因表達的影響, 從而為納米緩釋丁酸鈉在草魚飼料中的生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

參照草魚營養需求, 配制6種等氮等能的基礎飼料, 在草魚基礎飼料中分別添加納米緩釋丁酸鈉,添加量為0、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%和0.8%。豆粕和魚粉等大顆粒飼料原料經粉碎機粉碎后過40目篩篩選, 確保原料粉碎充分、均勻。原料的混合采用逐級放大法進行混合, 先將微量組分充分混合均勻后, 再添加大宗原料豆粕和大米蛋白等, 最后與魚油和水充分混合, 采用SLX-80型(上海飼料機械制造有限公司)顆粒飼料機制粒, 粒徑為2.5 mm, 晾干備用。實驗飼料配方見表1。

表1 飼料配方及生化組成(%干物質)Tab. 1 Formulation and chemical composition of feed (% dry matter)

1.2 動物飼養與管理

實驗用草魚由湖南省水產科學研究所(湖南,長沙)提供, 養殖實驗在長沙學院網箱養殖基地進行, 網箱規格為長200 cm×寬200 cm×深250 cm, 每個網箱內飼養50尾初始體重為(18.65±0.21) g, 大小規格一致的草魚, 喂食60d, 實驗共6個處理, 每個處理設3個重復, 以不添加丁酸鈉組為對照組; 其他為處理組, 分別編號0.1%組、0.2%組、0.4%組、0.6%組和0.8%組。每天于8: 30、12: 30和16: 30投喂, 共投喂3次, 投喂量隨魚體質量而增加, 第一周投喂量為魚體質量的5%, 以后每周增加1%, 在自然條件下養殖。每天記錄天氣狀況、水溫變化狀況、投喂量和攝食狀況。

1.3 樣品采集與分析

生長性能指標在養殖實驗結束后, 實驗魚禁食24h, 分別稱量每網箱魚的總體重并記錄魚總數量, 按照公式分別計算每個處理組的草魚平均體重、成活率、增重率、蛋白質效率和特定生長率。每個網箱隨機取出6尾實驗魚, 分別測量其體重和體長, 按照公式計算肥滿度。計算公式如下:

成活率(SR, %)=終末尾數/初始尾數×100;

增重率(WGR, %)=(末均體重–初均體重)/初均體重×100;

蛋白質效率(PER)=體增重/(攝食量×飼料蛋白質含量);

特定生長率(SGR, %/d)=(ln末均體重–ln初均體重)/實驗天數×100;

肥滿度(CF, g/cm3)=體重/體長3×100。

飼料常規營養成分測定實驗飼料中的粗蛋白、粗脂肪和灰分的測定參照AOAC(2003)標準方法: 采用凱氏定氮儀(2300, Kjeltec Analyzer Unit)測定粗蛋白; 粗脂肪采用索氏抽提儀(SoxtecSystem HT6, Tecator, Hoganas, Sweden)進行測定; 灰分在馬弗爐中550℃煅燒3h, 采用失重法測定。

前腸的分離及黏膜形態測定和PepT1基因表達量的測定每個重復隨機取6尾魚, 分離前腸, 用4%多聚甲醛溶液進行固定, 石蠟切片, 并用HE染色法染色, 普通光學顯微鏡觀察拍照, 并在40倍鏡下隨機選取10根生長平直、舒展和完整的絨毛, 測量絨毛高度及隱窩深度, 并計算絨毛高度/隱窩深度的比值。每個重復另取6尾魚, 冰上解剖并分離前腸, 6尾魚腸道組織合為一個樣品, 迅速投入液氮中保存待用。

血清生化指標測測定在養殖結束后每個網箱隨機取6尾魚, 尾靜脈采取血液, 采血過程中注意輕拿輕放, 防止溶血現象的發生, 全血放入4℃冰箱, 次日用Eppendof5804R臺式離心機, 4℃, 4000 r/min離心10min, 上層血清–80℃保存待測。用日立7170A型自動生化測定儀檢測血清總蛋白、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和尿素氮等指標。

血清游離氨基酸的測定血清采集方法同上, 吸取100 μL血清樣品加入100 μL預冷的乙腈,旋渦振蕩混勻, 放入4℃冰箱中20min, 沉淀蛋白質,12000 r/min離心10min, 取上清100 μL, 加入50 μL PITC衍生劑和50 μL三乙胺, 室溫避光衍生1h后12000 r/min離心10min, 上清中加入等體積的正己烷振蕩混勻后靜置15min, 去除過剩的衍生劑, 取下層液, 采用高效液相色譜柱法測定血清中游離氨基酸。

熒光定量引物設計及合成以GenBank中草魚PepT1基因為依據, 用Primer Premier 5.0軟件設計熒光定量PCR引物, 并設計草魚管家基因βactin引物作為內參引物, 引物由長沙擎科生物科技有限公司合成。β-actin上游引物: 5′-GAACACTGT GCTGTCTGGAGGTA-3′, 下游引物: 5′-CTTGGGTT GGTCGTTTGAATC-3′; PepT1上游引物: 5′-TGCT CTTGTTGTGTTCATCG-3′, 下游引物: 5′-CTCTCTC TTGGGGTATTGCTT-3′。

前腸總RNA提取及cDNA第一鏈的合成取出腸道組織, 在研缽中用液氮研磨, 按照OMEGA公司EZNATMTotal RNA KitⅡ的操作說明提取RNA, 并消化去除DNA; cDNA第一鏈的合成: 按照Fermentas公司RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒方法進行反轉錄合成cDNA第一鏈, –20℃保存備用。

腸道PepT1基因表達水平的分析參考Kenneth等[15]的報道, 采用熒光定量PCR方法測定PepT1基因在腸道中的相對表達量, 按照TaKaRa公司SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒反應體系, 在Thermofisher公司Quant Studio 3 Real-Time PCR System實時熒光定量PCR儀上進行熒光定量分析。反應體系如下: SYBR Premix ExTaq12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL, 用ddH2O補齊體積至25 μL, 每個樣品重復3次。反應程序: 95℃預變性30s, 95℃變性3s、55℃退火25s、72℃延伸11s共40個循環。根據擴增曲線得出Ct值,用公式2–ΔΔCt［ΔΔCt=(Ct,目的基因?Ct,管家基因)–ΔCt校準樣］計算基因相對表達豐度[16,17]。

1.4 數據統計分析

本文中所有實驗數據均以平均值±標準誤(Means±SE)表示, 用EXCEL(2013)進行計算和基本統計, 用SPSS軟件(版本17.0)進行統計分析。實驗數據經方差齊性檢驗后, 進行單因素方差分析(One-way ANOVA); 若各實驗組間差異顯著, 則進行Duncan’s多重比較; 以P<0.05判定為顯著性差異。

2 結果

2.1 納米緩釋丁酸鈉對草魚生長性能的影響

如表2 所示, 經過60d的養殖實驗, 0.6%組草魚全部成活, 草魚沒有出現死亡與其他組有顯著差異(P<0.05), 其他各處理之間都有死亡, 但沒有顯著差異; 增重率、特定生長率和肥滿度3個指標方面, 隨丁酸鈉的濃度升高出現先升后降的趨勢, 0.2%、0.4%和0.6%組草魚增重率相比對照都有顯著升高,以0.6%組升高最顯著(P<0.05); 相比對照組, 各丁酸鈉處理組的餌料系數均有不同程度升高, 但0.6%組與對照組無顯著差異(P>0.05); 各丁酸鈉處理組的蛋白質效率相比對照組都有不同程度降低, 但0.6%組與對照組接近, 無顯著差異(P>0.05)。

表2 納米緩釋丁酸鈉對草魚生產指標性能的影響Tab. 2 Effects of sustained release nanosphere sodium butyrate on the growth of grass carp

2.2 納米緩釋丁酸鈉對草魚腸道黏膜形態的影響

如表3所示, 納米緩釋丁酸鈉對草魚腸絨毛高度和隱窩深度的影響, 隨著丁酸鈉濃度升高, 草魚腸絨毛高度逐漸增加, 隱窩深度逐漸變淺(圖1)。當飼料中納米緩釋丁酸鈉添加量為0.6%時, 腸絨毛高度與隱窩深度的比值最大, 與對照組有顯著差異(P<0.05), 當超過這個濃度時則出現了負面影響。

圖1 不同處理組草魚腸道黏膜形態光鏡下比較(×40)Fig. 1 Intestinal mucosa morphology of grass carp in different groups under optical microscope (×40)

表3 納米緩釋丁酸鈉對草魚腸道黏膜形態的影響Tab. 3 Effects of sustained release nanosphere sodium butyrate on intestinal mucosa morphology of grass carp

2.3 納米緩釋丁酸鈉對草魚血清生化指標的影響

如表4所示, 在飼料中添加0.4%和0.6%丁酸鈉會顯著提高草魚血清中總蛋白含量, 而添加0.1%和0.8%丁酸鈉則會顯著降低血清中總蛋白含量(P<0.05); 球蛋白含量除在0.4%添加組與對照組沒有顯著性差異以外, 其他各添加組球蛋白含量均顯著低于對照組(P<0.05); 各添加組的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶含量相比對照組均出現下降, 當丁酸鈉添加量為0.6%時, 這2個酶的含量與對照組差異不顯著(P>0.05); 血清中尿素氮含量隨丁酸鈉濃度升高而顯著逐漸下降。其中尿素氮在0.6%丁酸鈉添加組含量達到最低值(P<0.05); 在血清中葡萄糖含量在丁酸鈉濃度0.2%和0.8%時與對照組無顯著差異(P>0.05), 而其余各添加組則顯著低于對照組(P<0.05)。

表4 納米緩釋丁酸鈉對草魚血清生化指標的影響Tab. 4 Effects of sustained release nanosphere sodium butyrate on serum indices of grass carp

2.4 納米緩釋丁酸鈉對草魚血清游離氨基酸的影響

各丁酸鈉處理組血清中氨基酸含量隨著丁酸濃度的升高而逐漸增加, 且在0.6%丁酸鈉處理組達到最高, 隨后下降, 其中組氨酸和脯氨酸變化最為明顯(表5)。氨基酸總量和必需氨基酸也具有同樣的趨勢, 在0.6%丁酸鈉添加組與對照組差異顯著(P<0.05)。

表5 納米緩釋丁酸鈉對草魚血清游離氨基酸的影響Tab. 5 Effects of sustained release nanosphere sodium butyrate on serum free amino acids of grass carp

2.5 納米緩釋丁酸鈉對草魚腸道PepT1 mRNA表達的影響

隨著丁酸鈉添加比例的增加, 草魚腸道PepT1 mRNA相對表達量呈上升趨勢(圖2); 其中,PepT1 mRNA在添加0.6%丁酸鈉濃度時相對表達量最高,與對照組差異顯著(P<0.05), 在添加0.8%丁酸鈉濃度時相對表達量最低(P<0.05)。

圖2 納米緩釋丁酸鈉對草魚腸道PepT1表達量的影響Fig. 2 Effects of sustained release nanosphere sodium butyrate on PepT1 relative expression of grass carp

3 討論

3.1 納米緩釋丁酸鈉對草魚生長性能的影響

在本實驗中, 飼料中不同丁酸鈉處理組的草魚成活率、增重率、特定生長率和肥滿度相比對照組均有一定程度提高, 而餌料系數和蛋白質效率與對照組接近, 無顯著差異, 尤其以0.6%組效果最顯著, 表明在飼料中添加適量的納米緩釋丁酸鈉, 會提高促進草魚的成活率, 促進生長。丁酸鈉的促生長效果在畜禽動物上已有不少研究報道。張瑞陽等[18]研究發現, 在飼糧中添加包被的丁酸鈉可明顯提高斷奶仔豬的生長性能。相似的是, 在斷奶后小母牛飼料中添加丁酸鈉對其生長性能和飼料效率均有促進作用, 且對消化道總表觀消化率不產生負面影響[19]。Bortoluzzi等[20]研究表明, 在營養不良日糧的肉雞飼料中添加丁酸鈉, 可調節其盲腸微生物群并提高其免疫功能, 對其生長性能也有積極促進作用。在水產動物上, 還殿宇等[12]在魚粉含量為12%的飼料中添加0.2%檸檬酸或丁酸鈉, 可顯著改善凡納濱對蝦生長性能, 提高飼料的利用效率。羅玲等[21]在飼料中添加適量微囊丁酸鈉, 發現團頭魴的非特異性明顯增高, 主要原因是因為提高了飼料利用率, 促進其健康生長。Zhou等[22]研究了3種不同類型的丁酸鈉在不影響魚體生長的情況下, 分別降低了魚體的脂質積累, 可能對魚苗的健康生長及發育有一定的促進作用。魏朝青等[23]在飼料中添加0.15%的丁酸鈉研究其對大菱鲆幼魚的影響, 發現丁酸鈉提高了其生長性能等生長指標, 但是添加過多的丁酸鈉會大大降低其生長性能。由此表明,在飼料中添加丁酸鈉具有良好的促進生長作用, 但是要把握其添加量。在本實驗中, 草魚在0.6%組的成活率明顯高于對照組, 而且其餌料系數和蛋白質效率指標與對照組無明顯差異, 說明0.6%濃度的丁酸鈉對草魚具有一定的促生長效果, 這與上述研究報道相似, 表明在飼料中添加納米緩釋丁酸鈉有一定的正面作用, 最佳添加量為0.6%。但并不是丁酸鈉的濃度越高越好, 在添加濃度過高的實驗組, 其生長效果及其他指標并不理想, 可能是過高的丁酸鈉濃度抑制了腸道上皮細胞的生長, 從而降低了機體對營養物質的吸收利用, 具體原因有待進一步研究。

3.2 納米緩釋丁酸鈉對草魚腸道黏膜形態的影響

水生動物的消化系統沒有胃, 腸道在食物的消化吸收中發揮重要作用, 但是水生動物的腸道壁都很薄, 植物性配合飼料中抗營養因子會造成魚類腸道損傷, 抑制腸道黏膜上皮細胞的增殖和分化, 進而影響整個腸道的健康狀況。研究表明, 丁酸鈉在高等脊椎動物如牛和雞的飼料中應用比較廣泛, 能促進其腸道細胞的增值與成熟[24,25]; 丁酸鈉在水生動物的應用中也表現出較好的促進魚類腸道發育及增值的效果, 孫浪等[26]研究發現, 在飼料中添加一定濃度的丁酸鈉能有效促進鯽腸道上皮細胞的增殖, 汪富榮等[27]在匙吻鱘飼料中添加1.0 g/kg的丁酸鈉, 促進了匙吻鱘腸道絨毛的生長與增殖, 腸道絨毛高度與隱窩深度的比值顯著增加。在本實驗中, 當飼料中納米緩釋丁酸鈉添加量為0.6%時,腸絨毛高度最高, 隱窩深度最淺, 其比值與對照組相比顯著增加 (P<0.05), 表明丁酸鈉對于草魚腸道上皮細胞的生長與增殖具有很好的促進作用, 與上述研究結果一致。

3.3 納米緩釋丁酸鈉對草魚血清生化指標的影響

魚體的身體健康及物質的代謝可以通過監測其血清生理生化指標的變化來評價。血清中的一些酶活力水平可以反映蛋白、肽類及氨基酸等物質的吸收代謝狀況, 球蛋白等指標可以直觀的反映機體健康及免疫狀況[28,29]。在本實驗中, 草魚血清中的總蛋白和球蛋白含量在0.4%組和0.6%時相比對照組顯著增加, 說明在飼料中添加納米緩釋丁酸鈉后, 有利于草魚對飼料中蛋白質等各種營養成分的吸收和利用, 蛋白質合成速度加快, 免疫力增強,間接的促進了草魚的生產性能。AST和ALT是氨基酸代謝中重要的轉氨酶, 主要分布在心臟和肝臟中, 在正常情況下, 血清中轉氨酶活力在一定范圍內的升高, 表示機體對蛋白質的合成、利用和分解代謝增強[28,30]。在本實驗中, 各丁酸鈉添加組這兩種酶的活力均低于對照組, 沒有差異, 說明飼料中的納米緩釋丁酸鈉能有效提升魚體蛋白質的代謝,而且不會損傷肝臟, 從而有助于魚體內蛋白質的合成與積累。

血清中的尿素氮是蛋白質等含氮有機物代謝的終產物, 血清中尿素氮的含量可以反映體內蛋白質代謝的狀況及腎臟功能的好壞[31]。Malmolf等[32]研究認為, 蛋白質和氨基酸之間的代謝平衡關系可以通過血清中的尿素氮含量來衡量, 在一定范圍內,尿素氮的含量越低表明蛋白質合成效率越高, 越有利于營養物質的吸收和利用。在湘云鯽(Carassius auratusTrip1)[33]和匙吻鱘(Polyodon spathula)[34]等水產動物中發現, 丁酸鈉可以顯著降低血清中尿素氮的含量, 從而達到蛋白質的高效利用。在本實驗中, 0.6%添加組組草魚血清中的尿素氮含量最低,且與對照組相比差異顯著, 說明飼料中添加納米緩釋丁酸鈉能有效提高草魚對飼料中蛋白質的吸收利用效率及蛋白質的合成效率。

葡萄糖是機體的主要供能物質, 血清中葡萄糖含量是機體營養狀況的一個重要指標[35], 飼料中的營養素的吸收轉運對血糖有較大影響。在本實驗中, 0.6%組草魚血清中葡萄糖含量與對照組無顯著差異, 說明飼料中納米緩釋丁酸鈉不會影響草魚對營養物質的消化吸收, 不會對營養狀況造成負面影響吧。

3.4 納米緩釋丁酸鈉對草魚血清游離氨基酸的影響

血清中游離氨基酸直接參與機體氨基酸的代謝和蛋白質的合成與積累, 其含量高低反應機體的營養狀況[36]。汪富榮等[34]研究發現, 丁酸鈉能顯著提高匙吻鱘血清中蛋氨酸等氨基酸含量; 孫浪等[33]在湘云鯽的飼料中添加丁酸鈉, 發現丁酸鈉濃度為2.5 g/kg時, 血清中游離氨基酸含量最高。在本實驗中, 飼料中添加一定量的納米緩釋丁酸鈉, 能影響草魚血清中的游離氨基酸含量, 各中氨基酸的總體趨勢是先增后減, 在0.6%添加組, 其氨基酸總量和必需氨基酸含量顯著提高, 表明飼料中添加納米緩釋丁酸可以提高草魚血清中游離氨基酸含量, 進而表明草魚的營養狀況良好。

3.5 納米緩釋丁酸鈉對草魚腸道PepT1 mRNA表達的影響

蛋白質是魚類的重要營養物質之一, 飼料中蛋白質的消化、吸收和利用的情況直接決定了魚類對蛋白質的利用情況。傳統蛋白質代謝理論認為,飼料中蛋白質在進入魚類腸道后, 降解成氨基酸和小肽類分子, 大部分以小肽的形式被動物體吸收利用[37]。在動物小腸中負責吸收和轉運小肽(二肽和三肽)的功能單位是位于其上皮細胞中的小肽轉運載體PepT1(Oligopeptide transporter 1,PepT1),PepT1在小腸上皮細胞的表達水平將直接反應動物體對一部分蛋白質的利用效率。因此如何提高PepT1的表達量, 從而提高魚類對蛋白質的消化利用至關重要。自從Fei等[38]克隆出兔小腸中PepT1基因以來,此后很多學者證實PepT1主要在高等哺乳動物中小腸上皮細胞中表達, 是小腸轉運小肽的關鍵載體。近年, 關于魚類的PepT1基因的研究日趨成熟, 發現魚類PepT1基因也主要是在魚類腸道上皮細胞中表達, 且主要集中于前腸, 在肝和腎中有少量表達[39]。目前, 國內淡水魚如鱖[40]、草魚[41]和鯽[42]等魚類的PepT1基因已被克隆得到, 為本研提供了研究基礎。在本實驗中, 草魚在0.6%丁酸鈉添加組的腸道PepT1基因表達量相比對照組顯著升高(P<0.05)。在高等動物中也有類似的實驗結果, 丁酸鈉能顯著增加豬小腸黏膜上皮細胞PepT1的表達量[43]。在魚類中, 吳凡等[44]在飼料中添加γ-氨基丁酸和丁酸鈉,發現丁酸鈉能顯著提高草魚腸道PepT1 mRNA的表達量; 孫浪等[26]也研究發現, 包膜丁酸鈉能顯著提高鯽魚腸道PepTl的表達水平。本實驗結果與前述研究結果一致, 說明在飼料中添加一定量的納米緩釋丁酸鈉會顯著影響腸道PepT1基因的表達量, 從而促進魚體對蛋白質的吸收利用。

4 結論

本實驗結果表明, 在草魚飼料中添加0.6%的納米緩釋丁酸鈉, 對于草魚的生長性能和飼料利用率均未受到顯著負面影響; 在飼料中添加適量(0.6%)的納米緩釋丁酸鈉對魚類具有保護腸道, 提高免疫力, 促進生長, 上調魚腸道中小肽轉運基因PepT1的表達水平。綜上所述, 建議草魚飼料中添加納米緩釋丁酸鈉的量0.6%。